Введение
Различные параметры крови давно применяются для диагностики состояния организма животных и человека. Однако ряд биохимических показателей крови рыб стали изучать сравнительно недав-
но [1, 2]. Кровь рыб является лабильной субстанцией организма, которая быстро изменяет свои характеристики при воздействии эндогенных и экзогенных факторов различной этиологии.
Общее количество белка и его фракционный состав являются объективными и часто применяемыми индикаторами оценки общего здоровья рыб [3], эти параметры лабильны, меняются как при смене физиологического состояния рыб, так и при внешних воздействиях, интенсивность которых выше пороговых значений для конкретных показателей [4]. Имеются сведения, что морфофункциональные и биохимические показатели крови рыб могут быть косвенными индикаторами состояния водных экосистем [5].
В настоящее время все больший интерес приобретают исследования, позволяющие оценить физиологический статус рыб с использованием индикаторных ферментных систем. В этом аспекте применяются исследования, позволяющие оценить активность антиоксидантных ферментов [6], а также активность аминотрансфераз (аланин- и аспартатаминотрансферазы (АЛТ и АСТ соответственно)), проявление активности которых в сыворотке крови так или иначе характеризует состояние и/или степень повреждения некоторых органов, в т. ч.
и печени [7].
Растительноядные рыбы дальневосточного комплекса в последние десятилетия стали компонентом ихтиоценозов дельты Волги. Являясь в значительной степени консументами первого порядка, растительноядные рыбы могут быть важными объектами мониторинга водных экосистем, в т. ч. и в аспекте влияния загрязнения на живые организмы. Консументы высших порядков подвержены процессу биомагнификации, когда концентрация загрязняющих веществ повышается, порой на несколько порядков, по мере продвижения по пищевой цепи.
В то же время реакция растительноядных рыб в большей степени зависит от текущего загрязнения водной среды, поэтому необходимость изучения их физиологического состояния не вызывает сомнений. Однако для мониторинговых исследований необходимо получение базовых значений тех показателей, которые будут в дальнейшем применяться для оценки влияния качества окружающей среды на рыб.
Цель работы – изучение особенностей содержания общего белка и его фракций, а также аминотрансфераз (АСТ и АЛТ) в сыворотке крови растительноядных рыб в условиях искусственного культивирования.
Материал и методы
Место исследования. Рыба, использованная для данного исследования, содержалась в прудах рыбоводного хозяйства Астраханской области.
Объект исследования. Для анализа были использованы белый амур Ctenopharyngodon idella и белый толстолобик Hypophthalmichthys molitrix обоих полов в возрасте от сеголеток до 4 лет. Рыбы подвергались видовому, возрастному и половому анализу по общепринятым методикам [8].
Забор крови и определение гематологических показателей. Перед отбором проб отловленные из пруда рыбы были помещены в бассейны, подключенные к установке замкнутого водоснабжения. Перед забором крови производили анестезию препаратом трикаинметанесульфанат (концентрация – 0,05 г/л, экспозиция – 2–3 минуты). Кровь собирали путем пункции хвостовой артерии. Сыворотку получали путем отстаивания крови в холоде.
Биохимический анализ. Для определения активности аминотрансфераз использовалась только сыворотка без ледов гемолиза [9]. Общий белок и альбуминовую фракцию определяли фотометрическим методом (биуретовым и бромкрезоловым соответственно), активность аминотрансфераз – унифицированным колориметрическим методом Райтмана и Френкеля с помощью набора реактивов «Протеин-Ново», «Альбумин-Ново», «Трансаминаза-АЛТ-Ново», «Трансаминаза-АСТ-Ново» [10].
Результаты исследований
Характеризуя данные по общему белку, представленные на рис. 1 (где ОБ – общий белок), необходимо, прежде всего, указать на отсутствие каких-либо существенных различий между исследованными растительноядными рыбами.
Рис. 1. Содержание общего белка в сыворотке крови растительноядных рыб
Fig. 1. Total protein content in the blood serum of herbivorous fish
В среднем, уровень общего белка у белого амура составляет 40,08 г/л, у белого толстолобика – 42,42 г/л.
Были выявлены различия по такому показателю, как общий белок сыворотки крови у рыб в возрасте до года. У сеголетков обоих исследованных видов растительноядных рыб больше общего белка содержится в сыворотке крови самок по сравнению с самцами, у годовиков это соотношение смещается в пользу самцов. При этом показано, что у рыб в возрасте от 1 до 3 лет включительно отсутствуют половые различия по содержанию в сыворотке крови общего белка.
Достоверные отличия по показателю содержания общего сывороточного белка выявлены также у белого толстолобика в возрасте 4 лет, его уровень выше у самок по сравнению с самцами (см. рис. 1).
Размах колебаний в содержании общего белка у самцов белого амура (31,55–55,37 г/л) выше, чем у самок (38,27–41,65 г/л). У белого толстолобика амплитуда содержания общего белка у самок и самцов примерно одинакова (31,96–49,29 и 30,46–48,31 г/л соответственно). Полученные данные по содержанию в сыворотке крови общего белка у белого амура и белого толстолобика можно принять за физиологическую норму для этих видов.
Различия в содержании общего белка в сыворотке крови растительноядных рыб осенью и весной статистически не достоверны, Р > 0,05.
Возрастные изменения сывороточных белков исследованных растительноядных рыб имеют неоднозначный характер (см. рис. 1). У белого амура максимум содержания общего белка (55,37 г/л) выявлен у самцов в возрасте 1 года, а у самцов в двухлетнем возрасте этот уровень снижается в 1,6 раза и в дальнейшем повышается очень незначительно. Что касается самок, то этот показатель в возрастном аспекте более стабилен, у всех возрастных групп значения концентрации общего белка в сыворотке крови изменяются в достаточно узком диапазоне (38–41 г/л).
Пик содержания общего белка в сыворотке крови белого толстолобика (см. рис. 1) отмечен у трехлетних самцов и самок (48,31 и 49,29 г/л соответственно). У четырехлетних особей содержание общего белка снижается, причем наиболее заметно у самцов (P < 0,05).
Скорее всего, возрастное повышение концентрации сывороточных белков связано с интенсификацией метаболизма, конкретно, с метаболизмом в печени. Как известно, основная часть сывороточных белков синтезируется гепатоцитами. Интенсификация общего метаболизма наблюдается у рыб в связи с активным гонадо- и гаметогенезом, что объясняет возрастное возрастание содержания сывороточных белков. По достижении определенного пика содержания (обычно в возрасте полового созревания) количество общего белка в сыворотке крови рыб либо снижается, либо стабилизируется, что обусловлено стабилизацией обмена веществ. При этом выявлен половой диморфизм в содержании общего белка у исследованных видов рыб.
В сезонном аспекте выявлено наиболее высокое содержание альбуминов осенью. Вероятно, это обусловлено функциональным состоянием рыб, поскольку весной организм рыб истощен после зимы, и в нем происходят глубокие перестройки, связанные с подготовкой к нересту.
Лидером по содержанию альбуминов являются сеголетки белого толстолобика (28,06 г/л), у самцов этого вида наблюдается значительное снижение содержания альбумина в сыворотке крови
с возрастом от 28 до 12 г/л. У самок белого толстолобика возрастная динамика уровня альбумина в сыворотке крови более сглажена. Значимые половые различия характерны для сеголеток и годовиков белого толстолобика, уровень альбуминов у самцов в 2 раза превышает таковой у самок (рис. 2, где А – альбумин).
Рис. 2. Содержание альбумина в сыворотке крови растительноядных рыб
Fig. 2. Albumin content in the blood serum of herbivorous fish
Содержание альбуминов в сыворотке крови у исследованного белого амура составляет величину от 14,0 до 22,0 г/л, причем выявляемые половые различия недостоверны (Р > 0,05) (см. рис. 2). Наибольшее содержание альбуминов отмечено у годовалых самцов и самок белого амура (18,45 и 22,14 г/л соответственно), затем значения данного показателя немного снижаются. Повышение количества альбуминов в крови обычно связывают
с быстрым ростом и интенсивным питанием рыб.
Сезонная динамика глобулинов в сыворотке крови рыб имеет свои особенности, отличные от динамики общего белка и альбуминов. Так, у белого толстолобика больше глобулинов выявлено весной по сравнению с осенью (Р < 0,05). Для белого амура высокий уровень глобулинов (как и альбуминов) отмечен в осенний период.
Показано, что имеются достоверные различия по содержанию в крови глобулинов у самцов и самок у сеголетков и годовиков белого амура и белого толстолобика (в возрасте 0+ и 4 лет) (рис. 3, где
Г – глобулины).
Рис. 3. Содержание глобулинов в сыворотке крови растительноядных рыб
Fig. 3. The content of globulins in the blood serum of herbivorous fish
Возрастные изменения глобулинов у изученных растительноядных рыб в целом характеризуются более динамичным характером, по сравнению с альбуминами. Это выражается в большем разбросе показателей содержания глобулинов у разновозрастных рыб одного вида.
Установлено, что больше всего глобулинов крови у самцов белого амура встречается в возрасте до 1 года (36,92 г/л). Второй максимум данного показателя был выявлен у самцов в возрасте 2+ (26,05 г/л), далее уровень содержания глобулинов в крови стабилизируется (см. рис. 3). Уровень содержания глобулинов в сыворотке крови самок белого амура мало изменяется на протяжении нескольких возрастных этапов – от сеголетки до четырехлетки (20–24 г/л).
Белому толстолобику, как и белому амуру, присущ значительный половой диморфизм по содержанию глобулинов (см. рис. 3). Так, у самцов толстолобика отмечено значительное повышение концентрации глобулинов до возраста 3 лет (31,36 г/л), а потом наблюдается его снижение почти в 2 раза.
У самок толстолобика максимальный уровень содержания глобулинов отмечен двумя пиками: у сеголеток и трехлеток около 32 г/л, а самки в возрасте 1 года и 4 лет характеризуются снижением этого показателя (18,35 и 26,2 г/л соответственно).
Белковый коэффициент сыворотки крови (соотношение «альбумины/глобулины») у белого амура с возрастом изменяется в пределах от 0,5 до 1,1, у белого толстолобика – от 0,5 до 3,1. В среднем, белковый коэффициент сыворотки крови белого амура и белого толстолобика равен 0,74 и 0,93 соответственно. Таким образом, соотношение отдельных белковых фракций меняется, скорее всего, изменения данного показателя могут происходить в связи с изменением характера питания и/или в связи с обеспеченностью пищей. Также имеет значение сезонные изменения интенсивности метаболизма
и сезонная цикличность процессов гаметогенеза.
Как известно, активность АСТ коррелирует со степенью поражения печени различной этиологии. Показано, что активность сывороточной АСТ у обоих видов растительноядных рыб повышена осенью (Р < 0,05). Вероятно, что к осени соответственно с повышенным общим метаболизмом в течение вегетационного периода возрастает и интенсивность протекания процессов, которые могут быть отнесены к патологическим. Так, отмечается изменение (возможно, и нарушение) процессов перекисного окисления липидов в мышечной ткани, обусловленное накоплением в прудах токсикантов, органики на разных стадиях деструкции и вероятным, более высоким уровнем паразитарных инвазий в этот период.
Половые различия активности АСТ наиболее ярко выражены у годовиков белого амура (рис. 4, а), у самцов которых уровень активности АСТ в сыворотке крови достоверно выше (Р < 0,05), чем у самок.
а б
Рис. 4. Возрастная динамика уровня АСТ в сыворотке крови: а – белого амура; б – белого толстолобика
Fig. 4. Age-related dynamics of AST levels in blood serum: a – white cupid; б – white carp
Обнаруженные половые различия активности АСТ, вероятно, определяются уровнем антиоксидантных реакций разнополых рыб и стресс-факторами.
У белого толстолобика четко прослеживается сходство возрастной динамики активности АСТ у самок и самцов. У самцов белого амура и белого толстолобика обоих полов наибольшая активность АСТ показана у годовиков (4,1–4,6 ммоль/л∙ч) с тенденцией к дальнейшему снижению. У самок белого амура пик активности АСТ наблюдается у сеголеток (3,5–3,9 ммоль/л∙ч), у особей старших возрастных групп значение этого показателя тоже падает в 1,5–2 раза.
Активности АЛТ – это более лабильный показатель по сравнению с активностью сывороточной АСТ. При этом наибольшая активность АЛТ была выявлена у белого толстолобика (9,8 ммоль/л∙ч), минимальная активность – у белого амура (0,26 ммоль/л∙ч), что говорит о том, что по данному показателю имеются выраженные межвидовые отличия, т. к. рыбы содержались в идентичных условиях. Что касается сезонной динамики, то выявлена выраженная тенденция повышения содержания АЛТ от весны к осени. Наибольшие различия в сезонном аспекте (Р < 0,05) по активности сывороточной АЛТ показаны у белого амура. Различия активности АЛТ в сыворотке крови толстолобика весной и осенью незначительны и недостоверны (Р > 0,05).
На рис. 5 показаны достоверные половые различия активности сывороточной АЛТ как у белого амура, так и у толстолобика (Р < 0,05).
а б
Рис. 5. Возрастная динамика уровня АЛТ в сыворотке крови: а – белого амура; б – белого толстолобика
Fig. 5. Age-related dynamics of ALT levels in blood serum: a – white cupid; б – white carp
Так, в сыворотке крови самок сеголеток белого амура (2,05 ммоль/л∙ч) уровень активности этого фермента в 2 и более раз выше, чем у самцов (0,78 ммоль/л∙ч). Самцы белого амура в возрасте
2 лет наоборот преобладают над самками по активности АЛТ в 2 раза (Р < 0,05).
Половые различия по содержанию сывороточной АЛТ белого толстолобика имеют несколько иной вид. Отмечено, что у двухлеток уровень активности АЛТ самок превышает аналогичные показатели у самцов, хотя различия недостоверны (Р > 0,05). У годовиков самцов напротив, активность АЛТ по сравнению с самками выше (8,76 и 3,45 ммоль/л∙ч соответственно). У особей белого амура и белого толстолобика более старших возрастных групп уровни аланинаминотрансферазы становятся практически равными (см. рис. 5).
Столь вариабельность показателя активности АЛТ по сравнению с АСТ, вероятно, связана с большей функциональной нагрузкой на печень рыб по сравнению с мышцами.
Возрастной динамике активности АЛТ у рыб свойственны закономерности, характерные для исследованных нами общего белка, альбуминов, глобулинов и аспарататаминотрансферазы. Так, мак-
симальное содержание АЛТ у растительноядных рыб и сазана присуще особям в возрасте 1 года (см. рис. 5), у рыб, старших по возрасту, этот показатель достоверно снижается (Р < 0,05).
Заключение
Содержание белка и в сыворотке крови рыб его фракционный состав является информативным экспресс-тестом для оценки физиологического состояния рыб, в т. ч. и в условиях аквакультуры. Влияние различных факторов окружающей среды, которые можно расценивать как дополнительная функциональная нагрузка, активирует синтез белков в сыворотке крови, что, в свою очередь, формирует специфический белковый статус, отличающийся видовыми особенностями и изменчивостью в зависимости от условий обитания рыб.
Белки сыворотки крови представляет собой динамическую систему, которая высокочувствительна к изменениям во внутренней среде организма под воздействием как абиотических, так и биотических факторов. Активность аминотрансфераз в сыворотке крови может служить информативным биологическим маркером оценки состояния здоровья рыб и качества окружающей среды, а в аквакультуре – для контроля условий выращивания. Анализ этих показателей у рыб в половом аспекте позволяет оценить их устойчивость к воздействию стрессовых факторов и адаптационные возможности, которые могут различаться в зависимости от пола.
Установлено, что уровень общего белка и его фракционный состав у растительноядных рыб варьирует в зависимости от сезона, пола и возраста. Осенью содержание альбуминов и глобулинов
у этих рыб увеличивается по сравнению с весной, за исключением толстолобика, у которого количество глобулинов в сыворотке крови выше весной. Половые различия в данных показателях наиболее заметны у рыб в возрасте от 0+ до 2 лет, у более взрослых особей рыб не обнаружено достоверных половых отличий по данным показателям. Уровень общего белка, альбуминов и глобулинов в сыворотке крови растительноядных рыб изменяется с возрастом. У белого амура максимальное содержание этих компонентов отмечено у годовиков, у белого толстолобика больше всего общего белка и глобулинов содержат трехлетние особи.
Уровень активности аминотрансфераз у растительноядных рыб также подвержен сезонной и возрастной динамике, у изученных видов обнаружены половые различия по этому показателю. Более высокая активность АСТ и АЛТ у белого амура и толстолобика характерна для осеннего периода по сравнению с весенним. Половые различия и уровень активности аминотрансфераз наиболее высоки у рыб ранних возрастных этапов. Более взрослые особи характеризуются снижением уровня активности АСТ и АЛТ в сыворотке крови,
а также незначительными половыми различиями по данным показателям или их отсутствием.
