ВведениеНа сегодняшний день не в полной мере реализован имеющийся потенциал криотехнологий для сохранения генофонда, восстановления популяций находящихся под угрозой исчезновения осетровых рыб, которые обладают низкой криорезистентностью. Для разработки методологических основ повышения толерантности спермиев данных реликтовых рыб к криоконсервации необходимо понимание молекулярных механизмов повреждения спермиев во время процесса замораживания и оттаивания [1]. Поскольку важным фактором криоповреждения спермиев является развитие окислительного стресса в репродуктивных клетках самцов рыб [2], в качестве протекторных добавок в базовые защитные среды могут использоваться антиоксиданты (АО) [3]. Известно, что при криоконсервации в спермиях рыб наблюдается гиперпродукция первоначальной активной формы кислорода (АФК) – супероксид анион-радикала, или супероксида (О2–• ) [4], который выступает ключевым триггером развития свободно-радикального процесса окисления, т. к. из него генерируются в дальнейшем другие более агрессивные АФК [5], включая и пероксид водорода (H2O2). В любой аэробной клетке О2–•  и H2O2 постоянно образуются в ходе метаболических процессов и при физиологических концентрациях играют важную роль в качестве сигнальных молекул [6], но в высоких концентрациях данные АФК могут снижать подвижностьи фертильность спермиев рыб [7]. Утилизация О2–•  и H2O2 системой антиоксидантной защиты спермиев рыб, представленной ферментами-антиоксидантами и низкомолекулярными AO, поддерживая концентрацию данных кислородных метаболитов на оптимальном уровне, предотвращает интенсификацию процессов свободно-радикального окисления. Поэтому актуально изучение влияния вносимых в базовые криосреды АО на способность сперматозоидов рыб утилизировать данные АФК. Целью исследований являлось определение влияния 2-(3,5-ди-трет-бутил-4-гидроксифенил)-4,7-диоксо-6-фенилоктагидро-1H-пирроло [2,3-d] пиридазин-3-карбоновой кислоты (1) и (1S,3R,3aS,6aR)-метил-3-(3,5-ди-трет-бутил-4-гидроксифенил)-5-(2-(2,5-диоксопирролидин-1-ил)фенил)-1-метил-4,6-диоксооктагидропирроло-[3,4-с]пиррол-1-карбоксила-та (2) в сравнении с реперным АО водорастворимым аналогом витамина Е – тролоксом на О2–• -, H2O2-утилизирующую активности спермы привлекательного объекта аквакультуры – сибирского осетра (Acipenser baerii, Brandt, 1869) до и после 3-х суток замораживания при температуре жидкого азота.  Материалы и методыРеагенты и растворы. Пирролидиновые производные 1 и 2 были синтезированы известными методами [8]. В работе использовались тролокс (6-гид-рокси-2,5,7,8-тетраметилхроман-2-карбоновая кислота) и другие коммерчески доступные реагенты (Sigma-Aldrich, США) без дополнительной очистки. Пирролидиновые производные и тролокс растворяли в среде Штайна, которая состояла из 12,5 % яичного желтка, 12,5 % диметилсульфоксида (ДМСО), 130 ммоль NaCl, 20 ммоль NaHCO3, 5,5 ммоль глюкозы и 5 ммоль KCl [9]. Конечная концентрация соединений в средах измерения составляла 0,1 ммоль.Сбор спермы. Объектом исследования являлась сперма сибирского осетра ленской популяции (Acipenser baerii, Brandt, 1869), полученная с конца апреля по середину мая 2023 г. от 5 самцов 17–25 лет. Самцам сибирского осетра вводили однократную инъекцию LH-RHa (лютеинизирующий гормон – рилизинг-гормон этиламид). Сперму собирали прижизненно с использованием катетера, охлаждали (8 ± 2 ºС) и доставляли в лабораторию в термоконтейнере. Все протоколы исследований были выполнены в соответствии с рекомендациями Комиссии по биоэтике Федерального государственного бюджетного учреждения науки «Федеральный исследовательский центр Южный научный центр Российской академии наук» (ЮНЦ РАН) (Протокол № 1 от 01.01.2024). Согласно заключению Комиссии по биоэтике, наши экспериментальные исследования соответствуют принципам биоэтики и правилам использования животных в научных целях.  Общая процедура замораживания и размораживания спермы. По методу Цветковой [10] была проведена криоконсервация спермы сибирского осетра. Сперму в количестве 500 мкл смешивали с 500 мкл криосреды Штайна в соотношении 1 : 1 и данную смесь распределяли по пробиркам Эппендорфа объемом 1,5 мл. Пробирки Эппендорфа со смесью помещали для эквилибрации в холодильник (Т = 4 °С) на 40 мин. Затем пробирки переносили в криозамораживатель PLANER (UK), постепенно охлаждая от 5 до –70 °С со скоростью 20–25 °С/мин (время замораживания около 3 мин). После этого этапа проводилась глубокая заморозка в жидком азоте в течение 3 сут. Температуру измеряли электронным термометром. Дефростацию проб спермы проводили с использованием водяной бани при температуре 38–40 °С в течение 30–40 с. Оценка способности спермы сибирского осетра утилизировать О2–• . Способность спермы сибирского осетра утилизировать О2–• определяли в модельной системе окисления адреналина в щелочной среде [11] по скорости образования промежуточного продукта окисления адреналина – адренолютина [12], определяемого при 347 нм. Для работы был использован 96-луночный микропланшетный спектрофотометр Multiskan Sky фирмы Thermo Fisher Scientifics (США). В лунки планшета добавляли 0,2 мл бикарбонатного буфера (pH 10,6) и 0,01 мл 0,1 %-го раствора адреналина (5,46 ммоль/л). Далее планшет помещали в спектрофотометр и измеряли оптическую плотность в режиме периодического встряхивания содержимого планшета. Скорость окисления адреналина до адренолютина оценивали в течение 300 с с добавками исследуемых соединений и без них (контроль). Контроль включал все компоненты, за исключением адреналина. Сперму смешивали с 0,2 М раствором Трис-буфера в соотношении 1 : 10 с помощью механического гомогенизатора. Далее для удаления частично разрушенных клеток и ядер смесь центрифугировали при 3 000 об/мин в течение 10 мин с использованием центрифуги Thermo Scientific SL16R (Thermo Fisher Scientific, Германия). Полученный супернатант был использован для измерения О2–• -утилизирующей способности спермы сибирского осетра.Снижение скорости окисления адреналина в присутствии супернатанта, содержащего сперматозоиды, свидетельствует об О2–• -утилизирующей способности спермы сибирского осетра. О2–• -утилизирующую активность рассчитывали относительно контроля, %, где за 100 % принимали окисление адреналина в щелочном бикарбонатном буфере без добавления спермы. Все эксперименты проводились в трехкратной повторности. Активность I, %, рассчитывали по формуле I = [(1 − Ai / A0) · 100],где Ai – оптическая плотность в пробе с добавлением тестируемых соединений; A0 – оптическая плотность в контроле (без добавок соединений).Оценка способности спермы сибирского осетра утилизировать Н2О2. Предварительно готовили смесь, содержащую 1 мл спермы (нативной или с добавлением раствора тестируемых соединений в ДМСО в конечной концентрации 0,1 ммоль) и 7 мл фосфатного буфера (рН 7,4). Далее полученную смесь центрифугировали в течение 10 мин (3 500 об/мин) и собирали надосадочную жидкость. В планшет помещали 100 мкл 30 ммоль раствора H2O2 в фосфатном буфере и 100 мкл надосадочной жидкости в фосфатном буфере. Контрольный образец вместо супернатанта содержал 100 мкл фосфатного буфера. Концентрацию H2O2 определяли методом спектрофотометрии (λ = 240 нм) [13] в течение 10 мин. Для каждого соединения было проведено по 3 параллельных независимых измерения. Исходя из полученных спектрофотометрических данных, были построены кинетические кривые расходования H2O2, линеаризованные в координатах уравнения первого порядка. Константы скорости реакции разложения H2O2 были рассчитаны по тангенсу угла наклона прямых. Изменение скорости разложения H2O2 в присутствии исследуемых соединений свидетельствует об их утилизирующей активности.Статистический анализ. С использованием программного обеспечения Statistica для Windows, версия 9.0 (StatSoft, Inc.), проведен статистический анализ полученных результатов, которые были представлены как среднее значение ±SD. С помощью t-критерия Стьюдента были проанализированы параметры антиоксидантной активности изучаемых соединений, где статистическая достоверность была установлена на уровне p < 0,05. Результаты и их обсуждениеСогласно полученным в работе данным, спермии сибирского осетра обладают способностью утилизировать О2–•  и Н2О2. О2–• -утилизирующая активность репродуктивных клеток обусловлена преимущественно действием антиоксидантного фермента супероксиддисмутазы (СОД), ускоряющего реакцию диспропорционирования О2–•  до молекулярного кислорода и H2O2. Поскольку H2O2 является более агрессивной и стабильной по сравнению с О2–•  АФК, которая, к тому же, в отличие от О2–• , менее полярна и может легко проходить через плазматическую мембрану [14], важное значение имеет способность спермиев утилизировать H2O2. В результате протеомного анализа в сперме сибирского осетра [15] идентифицирована цитозольная Cu/Zn-СОД изоформа (СОД1), которая является самой активной изоформой СОД, однако известно, что данный фермент легко подвергается окислительной модификации и инактивации АФК [16]. Анализ протеома спермы данного вида осетровых не выявил наличие в репродуктивных клетках важнейшего фермента, утилизирующего Н2О2 – каталазы, разлагающего Н2О2 до О2 и Н2О. Способность спермы сибирского осетра утилизировать Н2О2, по-видимому, обусловлена действием двух альтернативных ферментов: глутатионпероксидазы и глутатионредуктазы, которые вместе с СОД1 образуют единую метаболическую цепь, в которой продукт реакции одного компонента цепи (СОД1) является субстратом для других компонентов – ферментов, утилизирующих H2O2. В связи с этим эффективная антиоксидантная активность спермы рыб при криоконсервации обеспечивается сбалансированностью процессов утилизации данных видов АФК. Так, при резком повышении О2–• -утилизирующей активности спермы без соответствующей активации способности репродуктивных клеток утилизировать H2O2 может повыситься стационарная концентрация данной АФК [17], поэтому баланс между Cu, Zn-СОД и ферментами, удаляющими H2O2, имеет важное значение в антиоксидантной защите. Показано, что внесение в модифицированную среду Штайна фенольных производных и тролокса как до, так и после процесса замораживания-дефростации приводит к повышению скорости разложения Н2О2 спермой рыб по сравнению с контрольным вариантом без добавок АО (табл.), но при этом О2–• -утилизирующая активность данных клеток снижается.   О2–•-, H2O2-утилизирующие активности спермы сибирского осетрав присутствии исследуемых соединений до (I) и после (II) криоконсервации* О2–•-, H2O2-utilization activities of Siberian sturgeon spermin the presence of the studied compounds before (I) and after (II) cryopreservation СоединениеО2–•-утилизирующая активность,% ингибированияH2O2-утилизирующая активность, k · 105, с–1IIIIIIКонтроль50,52 ± 1,0434,64 ± 0,4920,3410,62135,03 ± 0,3027,91 ± 0,6191,5218,22243,03 ± 0,4529,19 ± 0,3421,6315,74Тролокс28,42 ± 0,7615,94 ± 0,3721,2214,72  * k – константа скорости разложения H2O2.  Стимулирование способности спермы сибирского осетра утилизировать Н2О2 представляется важным, учитывая токсическое влияние данной АФК на подвижность репродуктивных клеток рыб [7]. Наибольшее повышение H2O2-утилизирующей активности спермы рыб наблюдается в присутствии соединения 1 – до замораживания данная активность увеличилась в 4,5 раза, после замораживания – в 1,7 раза. Добавка остальных соединений, в том числе тролокса, в базовую криосреду оказалась более эффективной для дефростированной спермы, при этом стимулирование утилизации сперматозоидами H2O2 в присутствии гибридных фенольных производных превышало аналогичную активность тролокса (см. табл.). Известно, что при окислении адреналина в щелочной среде (бикарбонатный буфер, рН 10,65) кроме О2–•  образуется и H2O2 [18], в присутствии которого СОД1 обладает пероксидазной активностью, катализируя образование наиболее агрессивной АФК – гидроксильного радикала [19]. Данный активный метаболит способен окислять адреналин, промотируя генерирование О2–• , а также инактивировать фермент Cu/Zn-СОД. Таким образом, снижение О2–• -утилизирующей активности спермиев сибирского осетра в присутствии исследуемых соединений может быть связано с их влиянием на пероксидазную активность СОД1. До замораживания способность спермы сибирского осетра утилизировать О2–•  в присутствии соединений 1, 2 и тролокса снижается в 1,4, 1,2 и 1,8 раз соответственно. После криоконсервации при добавлении новых фенольных производных данная активность спермы уменьшается в 1,2 раза, при внесении тролокса – в 2,2 раза. Следует отметить снижение скорости утилизации О2–•  и Н2О2 спермой рыб после криоконсервации как в контроле, так и в присутствии исследуемых соединений, хотя в условиях гиперпродукции АФК на этапах замораживания и оттаивания для предотвращения окислительного повреждения молекул необходимо повышение способности спермы рыб утилизировать О2–•  и Н2О2. В контрольном варианте способность дефростированной спермы сибирского осетра утилизировать О2–•  и Н2О2 снижается, по сравнению с нативной спермой, в 1,5 и 1,9 раза соответственно. Для H2O2-утилизирующей активности наибольшее снижение наблюдается при добавлении соединения 1 (в 5 раз), для О2–• -утилизирующей активности – при добавлении тролокса (в 1,8 раза). Ослабление способности дефростированной спермы рыб утилизировать данные виды АФК может быть связано с высвобождением антиоксидантных ферментов из сперматозоидов в результате повреждения плазматической мембраны спермиев рыб при криоконсервации [20].Таким образом, в работе установлена способность гибридных фенольных производных снижать негативное влияние процесса замораживания на О2–• -, Н2О2-утилизирующую активность спермиев сибирского осетра. Соединение 1 демонстрирует криозащитный эффект в отношении О2–• -утилизирующей активности репродуктивных клеток при замораживании-дефростации, при этом соединение 2 и тролокс – в отношении H2O2-утилизирующей активности. Так, если в контроле способность репродуктивных клеток расходовать О2–•  при замораживании-дефростации снижается в 1,5 раза, то в присутствии соединения 1 – в 1,3 раза, что свидетельствует о его протекторной активности.  ЗаключениеПоказано, что пирролидинсодержащие фенольные производные, как и тролокс, способны стимулировать утилизацию репродуктивными клетками H2O2, при этом новые фенольные производные демонстрируют большую эффективность антиоксидантного действия по сравнению с реперным антиоксидантом. В работе установлено снижение О2–• -утилизирующей активности спермы сибирского осетра при внесении в модифицированную среду Штайна производных (3,5-ди-трет-бутил-4-гидроксифенил)-пирролидин-2-карбоновой кислоты, но в целом можно констатировать протекторный эффект данных соединений на ферментативное звено антиоксидантной защиты репродуктивных клеток рыб как до, так и после замораживания. Полученные результаты указывают на важность проведения дополнительных исследований в данном направлении.