Введение В настоящее время общепризнанным фактом является то, что эффективность производства продукции аквакультуры во многом зависит от способов использования разнообразных генетических ресурсов. Эффективные технологии воспроизводства рыбных запасов должны быть разработаны на основе изучения генетической и эпигенетической регуляции таких важных признаков аквакультуры, как устойчивость к болезням и стрессам, скорость роста, урожайность, репродуктивные характеристики, поведение. Активно обсуждаются возможности использования геномики, протеомики и транскриптомики в повышении эффективности аквакультуры [1]. Большое внимание привлекает использование эпигенетических факторов в аквакультуре: показано влияние эпигенетических факторов на повышение продуктивности, регуляцию соотношения полов, мышечную массу личинок, качество спермы у рыб [2–6]; отмечена роль эпигенетических факто-ров в формировании сердечно-сосудистой, мышечной, неврологической систем у личинок рыб [7]; рассматриваются варианты программирования питания с помощью измененного рациона у маточного стада леща и его влияние на качество икры, рост и развитие потомства [8]. Однако наряду с этими подходами высокоэффективными могут быть и ненаследственные способы увеличения важнейших характеристик аквакультуры: продуктивности и устойчивости рыб – через фенотипическую активацию с использованием генетически активных веществ. Среди многочисленных групп биологически активных соединений выделяется группа генетически актив-ных веществ, усиливающих процессы репарации (восстановления) – репарагенов. Среди известных репарагенов наибольшее внимание уже давно при-влекает парааминобензойная кислота (ПАБК). По сравнению с другими генетически активными веществами ПАБК не образует валентных связей с генетическим субстратом и ферментами и, тем не менее, усиливает переход генетического материала в сторону возросшей репарации [9, 10]. Известно, что ПАБК повышает устойчивость к болезням, увеличивает продуктивность растений, влияет на жизнеспособность рыб на ранних стадиях развития, увеличивает противовоспалительную активность; стимулирует выработку интерферона у мышей, влияет на газообмен и температуру тела у крыс-альбиносов, влияет на процессы апоптоза конъюнктивы и эпителия роговицы взрослых крыс in vivo после гипобарической гипоксии, стимулирует рост и развитие кур [11–20]. В исследованиях, проведенных на двух видах сиговых рыб рода Coregonus – пыжьяне С. lavaretus pidschian (Gmelin) и пеляди С. peled (Gmelin), – была показана способность ПАБК стабилизировать развитие зародышей, полученных из икры низкого качества [16]. В основе этого процесса лежит способность ПАБК образовывать комплексы с широким набором ферментов, увеличивая объем ферментативной репарации [9, 10]. В ранних работах была показана способность ПАБК влиять на дисконъюгацию и спирализацию хромосом, образовывать комплексы с хромосомами, блокируя возникновение хромосомных перестроек [21]. Возможность фенотипической коррекции эмбриогенеза с помощью ПАБК является интересной задачей, которую лучше всего решать, используя такой объект, как чир (Сoregonus nasus (Pallas,1776)), который среди разных видов сиговых рыб отличается генетической нестабильно-стью в период эмбрионального развития [22–24]. Целью настоящей работы является изучение способности ПАБК влиять на жизнеспособность чира (Сoregonus nasus (Pallas, 1776)) на ранних стадиях онтогенеза.Задачи:1. Изучить ПАБК в качестве фактора повышения жизнеспособности и скорости роста чира на ранних стадиях развития.2. Оценить способность ПАБК к уменьшению частоты спонтанных хромосомных нарушений у чира в период эмбриогенеза.Материал и методикаЭкспериментальные работы по воздействию ПАБК на рыб проводили с октября по июнь 2014–2018 гг. Объектом исследований служил чир (Coregonus nasus (Pallas, 1776)). Половозрелых рыб отлавливали в районе их нерестилищ (р. Ляпин, 63°39´53´´с. ш., 64°14´26´´ в. д.), сбор половых продуктов осуществляли от текучих производителей. Партии икры, собранной от нескольких самок, осе-меняли спермой нескольких самцов и тщательно перемешивали. Опыты с чиром были заложены на р. Ляпин во время промышленной заготовки икры сиговых рыб и затем переведены на Тобольский рыбоводный завод (г. Тобольск Тюменской области). Было осуществлено 2 постановки опытов: 2 и 4 ч воздействия, в каждой постановке по 2 производственных серии (повторы для получения статистически достоверного результата), использовалась икра разных самок.Первые серии опытов заключались в том, что икру сразу же после оплодотворения делили на 8 вариантов: 7 опытных вариантов выдерживали в растворах ПАБК разной концентрации (0,01; 0,005; 0,001; 0,0005; 0,0001; 0,00005; 0,00001 %), контрольный не обрабатывали ПАБК. Растворы ПАБК готовили на теплом физиологическом растворе (70 °С) Рингера–Локка, перед употреблением охлаждали до температуры отцеженных половых продуктов (+1,0–+1,2 °С). Для первых двух серий опытов время обработки (экспозиция) составила 2 ч. Затем обработанную икру промывали водой и закладывали на инкубацию в аппараты Вейса. Температура воды в аппаратах за период инкубации составляла в среднем +1,2 °С. Последующие серии опытов были аналогичными, различие заключалось в том, что время обработки икры ПАБК составило 4 ч.Личинок из контрольного и опытных вариантов высаживали в производственные проточные лотки для подращивания в количестве 2 500 шт. в каждом варианте опыта при кормлении артемиями (Artemia salina). Через 34 дня мальков подсчитывали, затем взвешивали по 50 шт. из каждого вариан-та.Цитогенетическую обработку зародышей чира проводили по стандартной ацетоорсеиновой методике [25]. Фиксировали зародыши на стадии гаструлы в фиксаторе Карнуа. Для окрашивания препаратов использовали орсеин фирмы «Merсk» (Германия), цитогенетический анализ проводили при увеличении 10 (окуляра) × 100 (объектива) с использованием микроскопа Axiostar plus фирмы Zeiss (Германия).Статистическую обработку данных проводили с использованием пакета прикладных программ Statistica.Результаты и обсуждениеСреди сиговых рыб, промышленное воспроизводство которых осуществляется заводским способом, чир отличается крайне низкой жизнеспособностью в период эмбрионального развития [26–28]. Считается, что возможная причина этого заключается в нестабильности кариотипа, что проявляется в повышенной частоте спонтанных хромосомных нарушений у этого вида [22–24]. Отмечается резкое сокращение численности обского чира в последние 30 лет (в 6 раз) [29]. Способность ПАБК стабилизировать развитие эмбрионов пыжьяна и пеляди, полученных из икры низкого качества [16], указывает на возможность фенотипической коррекции генотипа в эмбриогенезе в направлении нормализации с помощью этого генетически активного соединения. Рыбоводная практика показывает, что отрицательные особен-ности генотипа у рыб проявляются в форме гибели эмбрионов в периоды прохождения критических стадий в развитии, когда происходят резкие преоб-разования морфогенетических функций в сторону их усложнения и расширения. У рыб таковыми являются стадии гаструляции и предличиночный этап (при вылуплении эмбрионов из оболочек).В табл. 1 приведены результаты получения личинок чира с использованием ПАБК в различных концентрациях путем обработки оплодотворенной икры при экспозиции 2 ч. Таблица 1Table 1Результаты инкубации икры чира после обработки оплодотворенной икры ПАБК в разных концентрациях при экспозиции 2 чThe results of incubation of broad whitefish eggs after fertilized eggs treatment with PABA in different concentrations under 2-hour exposureКонцентрация ПАБК, %Количество оплодотворенной икры, тыс. шт.% развивающейся икры на стадии бластулыПолучено предличиноктыс. шт.в % от развивающейся икрыПервая серия опытов0,0112,4391,2 ± 1,155,7750,2 ± 0,460,00516,2492,6 ± 1,078,5857,9 ± 0,37*0,00117,8295,5 ± 0,8410,0159,2 ± 0,34*0,000517,3693,3 ± 1,0211,2069,1 ± 0,30*0,000118,4496,1 ± 0,79*11,2463,4 ± 0,32* Окончание табл. 1End of table 1Концентрация ПАБК, %Количество оплодотворенной икры, тыс. шт.% развивающейся икры на стадии бластулыПолучено предличиноктыс. шт.в % от развивающейся икрыПервая серия опытов0,0000517,6393,3 ± 1,0211,2468,3 ± 0,31*0,0000118,0594,4 ± 0,9311,2866,2 ± 0,31*Контроль23,4092,4 ± 1,0810,5848,9 ± 0,34Вторая серия опытов0,005 11,5093,4 ± 1,026,7763,2 ± 0,41*0,00116,1695,1 ± 0,8811,5575,1 ± 0,28*0,000516,6694,9 ± 0,8912,7080,3 ± 0,25*0,000117,9996,3 ± 0,7713,7279,2 ± 0,24*0,0000514,2296,3 ± 0,7711,9484,6 ± 0,23*0,0000118,0596,2 ± 0,7814,4780,1 ± 0,23*Контроль75,8695,1 ± 0,8843,5757,4 ± 0,17* Различие с контролем статистически достоверно на уровне р ˂ 0,01. Из анализа данных следует, что в двух сериях опытов процент развивающихся зародышей на стадии бластулы был высоким. Данный факт свидетельствует о том, что пониженная эмбриональная жизнеспособность не является результатом пониженной оплодотворяющей способности зрелых половых продуктов, а определяется факторами, проявляющимися после прохождения зародышами стадии бластулы. Обработка оплодотворенной икры ПАБК в семи концентрациях от 0,00001 до 0,01 % при экс-позиции 2 ч положительно повлияла на жизнеспо-собность эмбрионов. Результаты в последователь-ных сериях опытов повторяются, что свидетель-ствует о достоверности данных. В контроле было заложено значительно больше оплодотворенной икры (в 7–8 раз), и выход в абсолютных значениях (тыс. шт.) выше, чем в вариантах с ПАБК, но срав-нение проводилось по относительным показателям, по выходу в %. И в первой серии опытов преимущество опытных вариантов над контрольным (по выходу предличинок в % от развивающейся икры) колебалось в среднем от 1,3 до 20,2 %, во второй серии – от 5,8 до 27,2 %. Наименьший эффект отмечен в вариантах с применением ПАБК в самой высокой концентрации – 0,01 %, поэтому ее исключили из второй серии опытов. В диапазоне концентраций от 0,005 до 0,00001 % эффективность применения ПАБК проявилась примерно в равной степени.При увеличении экспозиции до 4 ч результаты инкубации икры чира были аналогичными (табл. 2). Таблица 2Table 2Результаты инкубации икры чира после обработки оплодотворенной икры ПАБК в разных концентрациях при экспозиции 4 чThe results of incubation of broad whitefish eggs after fertilized eggs treatment with PABA in different concentrations under 4-hour exposureКонцентрация ПАБК, %Количество оплодотворенной икры, тыс. шт.% развивающейся икры на стадии бластулыПолучено предличиноктыс. шт.в % от развивающейся икрыПервая серия опытов0,018,0084,9 ± 1,45*3,8556,7 ± 0,56*0,00511,8594,9 ± 0,896,5458,1 ± 0,43*0,0019,9495,4 ± 0,85*6,2766,0 ± 0,42*0,000511,2794,5 ± 0,937,8974,1 ± 0,35*0,00019,2694,3 ± 0,945,5463,4 ± 0,45*0,0000520,1495,9 ± 0,81*11,0857,3 ± 0,33*0,0000121,8194,0 ± 0,9712,3960,4 ± 0,31* Контроль89,1190,8 ± 1,1841,1050,8 ± 0,17Вторая серия опытов0,0059,8194,0 ± 0,975,4358,9 ± 0,47*0,00117,0695,8 ± 0,8110,6067,8 ± 0,32*0,000517,1993,0 ± 1,0411,7073,1 ± 0,29*0,000117,1693,8 ± 0,9811,2069,6 ± 0,30*0,0000517,9894,2 ± 0,9511,3767,1 ± 0,31*0,0000117,7695,3 ± 0,8611,7369,3 ± 0,30*Контроль79,7795,1 ± 0,8843,5757,4 ± 0,17* Различие с контролем статистически достоверно на уровне р ˂ 0,0. В первой серии опытов преимущество опытных вариантов с ПАБК по выходу предличинок (в % от развивающейся икры) над контрольным колебалось в среднем в пределах 5,9–23,3 %, в другой серии – в пределах – 1,5–15,7 %.Результаты подращивания личинок приведены в табл. 3 и 4. Таблица 3Table 3Результаты подращивания в течение 34 дней личинок чира, полученных из икры, обработанной ПАБК после оплодотворения при экспозиции 2 чThe results of rearing within 34 days of broad whitefish larvae obtained from roe treated with PABA after fertilization under 2-hour exposureКонцентрация ПАБК, %Посажено личинок, шт.Получено мальковМасса мальков, мг**(х ± mx)шт.в % от личинокПервая серия опытов0,0052 5002 19087,6 ± 0,50*31,9 ± 0,940,0012 32593,0 ± 0,37*35,1 ± 0,880,00052 31092,4 ± 0,39*35,6 ± 0,700,00012 38095,2 ± 0,31*35,2 ± 0,900,000052 16086,4 ± 0,52*39,0 ± 0,90*0,000012 26590,6 ± 0,43*36,7 ± 0,88*Контроль1 90276,1 ± 0,6932,8 ± 1,05Вторая серия опытов0,0052 5001 60064,0 ± 0,8542,1 ± 1,420,0011 72068,8 ± 0,79*52,9 ± 2,030,00051 68067,2 ± 0,81*52,7 ± 1,860,00011 74069,6 ± 0,78*58,2 ± 2,25*0,000051 76070,4 ± 0,77*58,7 ± 2,12*0,000011 61064,4 ± 0,84*56,1 ± 2,03Контроль1 53061,2 ± 0,8847,2 ± 1,94* Различие с контролем статистически достоверно на уровне р ˂ 0,01; ** в каждом варианте опыта взвешено по 50 мальков.Таблица 4 Table 4Результаты подращивания в течение 34 дней личинок чира, полученных из икры,обработанной ПАБК после оплодотворения при экспозиции 4 чThe results of rearing within 34 days of broad whitefish larvae obtained from roe treated with PABA after fertilization under 4-hour exposureКонцентрация ПАБК, %Посажено личинок, шт.Получено мальковСредняя масса мальков, мг**(х ± mx)шт.в % от личинокПервая серия опытов0,0052 5002 03581,4 ± 0,61*37,0 ± 1,090,0012 06583,4 ± 0,58*41,6 ± 0,97*0,00052 10584,2 ± 0,56*37,2 ± 1,110,00012 14585,8 ± 0,53*37,1 ± 1,140,000052 05082,0 ± 0,60*38,7 ± 0,96*0,000011 98579,4 ± 0,64*34,4 ± 1,00Контроль1 90276,1 ± 0,6933,6 ± 1,27Вторая серия опытов0,0052 5001 81072,4 ± 0,74*52,8 ± 1,710,0011 69267,7 ± 0,80*58,5 ± 1,75*0,00051 80572,2 ± 0,75*55,1 ± 1,76*0,00011 92076,8 ± 0,68*56,7 ± 1,68*0,000051 88175,2 ± 0,7052,2 ± 1,450,000011 78071,2 ± 0,76*52,8 ± 1,93Контроль1 53061,2 ± 0,8848,1 ± 1,84* Различие с контролем статистически достоверно на уровне р ˂ 0,01; ** в каждом варианте опыта взвешено по 50 мальков. Влияние ПАБК проявилось в ранний постэмбриональный период в преимуществе по жизнеспособности подопытных мальков над контрольными. При экспозиции действия ПАБК 2 и 4 ч в опытных вариантах было получено в среднем 1,2 раза больше мальков, чем в контрольных. Положительное действие ПАБК проявилось не только в повышении жизнеспособности рыб, но и в увеличении скорости роста мальков. Как видно из табл. 3, в первой серии опытов наиболее эффективными были самые низкие концентрации ПАБК (0,00005 и 0,00001 %), при воздействии которых масса мальков оказалась выше в 1,19–1,11 раза, чем в контрольном варианте. Во второй серии опытов максимальное увеличение массы тела в сравнении с контролем (в 1,23–1,24 раза) отмечено в вариантах с концентрациями ПАБК 0,0001 и 0,00005 %. При увеличении экспозиции до 4 ч в других вариантах опытов отмечено достоверное увеличение массы тела рыб. В первой серии опытов увеличение массы тела в 1,15–1,23 раза отмечено в вариантах с концентрациями ПАБК 0,00005 и 0,001 % соответственно, во второй серии опытов – в трех вариантах – 0,001, 0,0005 и 0,0001 % – отмечено увеличение массы в сравнении с контролем в 1,20; 1,14 и 1,17 раз соответственно.Цитогенетический анализ зародышей чира на стадии гаструлы выявил снижение частоты хромосомных перестроек во всех вариантах с ПАБК при экспозиции 2 и 4 ч (табл. 5). Таблица 5Table 5Встречаемость клеток с хромосомными нарушениями у зародышей чира на стадии гаструлы в опытах с воздействием ПАБК на оплодотворенную икруOccurrence of cells with chromosomal abnormalities in broad whitefish embryos at the gastrula stage in experiments with PABA treatment of fertilized eggsКонцентрация ПАБК, %Просмотрено зародышей, шт.Количество просмотренных клеток, шт.Средняя частота аномальных митозов на один зародыш, %Экспозиция 2 ч0,005202 76610,22 ± 0,48*0,001213 18010,98 ± 0,30*0,0005202 92012,09 ± 0,37*0,0001182 73010,47 ± 0,34*0,00005162 4349,27 ± 0,35*0,00001182 3899,94 ± 0,44*Экспозиция 4 ч0,005203 73419,58 ± 0,55*0,001203 34014,96 ± 0,34*0,0005203 13614,69 ± 0,40*0,0001162 47418,87 ± 0,41*0,00005182 80518,77 ± 0,54*0,00001162 37019,92 ± 0,51*Контроль203 11229,25 ± 1,04* Различие с контролем статистически достоверно на уровне р ˂ 0,01. При экспозиции 2 ч наибольший эффект ПАБК был отмечен в варианте с 0,00005 % концентрацией ПАБК, при экспозиции 4 ч – при концентрации 0,0005 %. Не было выявлено зависимости цитогенетического эффекта ПАБК от ее концентрации и длительности обработки икры (экс-позиции). Воздействие ПАБК на зародышевые клетки чира приводит к снижению частоты хро-мосомных нарушений в 1,5–2 раза сравнении с контролем. Проведенные исследования свидетельствуют об эффективности предложенного подхода – увеличении важнейших характеристик аквакультуры – жизнеспособности и продуктивности – через фенотипическую активацию с использованием генетически активного вещества – ПАБК. Известно, что данное соединение обладает высокой моди-фикационной способностью, высоким потенциа-лом взаимодействия с хромосомами и ферментами, с которыми ПАБК связывается и активизирует про-цессы репарации [9, 10, 12, 20, 30]. Так как объектом взаимодействия ПАБК в репарагенезе является генетический материал, становится по-нятной способность ПАБК эффективно восста-навливать хромосомные нарушения и оказывать положительное влияние на жизнеспособность и скорость роста чира на ранних стадиях развития.Выводы1. Использование малых концентраций ПАБК повышает выживаемость чира на ранних стадиях развития. Обработка оплодотворенной икры растворами ПАБК позволяет увеличить скорость роста чира в ранний постэмбриональный период. Максимальный эффект отмечен при использовании концентраций ПАБК 0,00005 и 0,0001 %.2. Обработка икры ПАБК уменьшает частоту хромосомных нарушений на стадии гаструлы у чира, повышая генетическую стабильность рыб в эмбриональный период.