ВведениеИсследования в области охраны здоровья объектов аквакультуры на сегодняшний день весьма актуальны, т. к. список лекарственных препаратов для применения в аквакультуре ограничен, а его расширение позволит интенсифицировать производственные процессы, получая продукцию высокого качества.Осетроводство было и остается одним из важных направлений как искусственного воспроизводства, так и товарной аквакультуры. Критическим этапом биотехнологии осетровых видов рыб является инкубация оплодотворенных ооцитов, длительность которой составляет всего 6–8 суток при температуре воды 13–17 °С (в зависимости от вида осетровых). Данные температуры являются оптимальными для развития микромицетов сем. Saprolegniaceae, относящихся к царству Chromista (Stramenopila), отделу Oomycota, классу Oomycetes, порядку Saprolegniales. Количество зараженной икры в процессе инкубации может варьировать и составлять более 50 % [1], что приносит огромный экономический урон рыбоводным хозяйствам. Большинство средств, используемых в аквакультуре для борьбы с сапролегниозом, в настоящее время не входят в государственный реестр лекарственных средств для ветеринарного применения.Несмотря на обширный список химических веществ с фунгицидными свойствами, а также множество проведенных исследований [2–9] по применению этих веществ в аквакультуре, разрешенные препараты практически отсутствуют, что может быть связано с длительностью процесса их апробации и внедрения в рыбоводную практику. Существует ряд лекарственных препаратов, использующихся в аквариумистике для лечения и профилактики сапролегниоза, но использование их в аква-культуре не разрешено, т. к. в большинстве случаев они содержат органические красители. В связи с этим поиск новых фунгицидных или фунгистатических веществ в отношении сапролегниевых микромицетов, а также разработка методики обработки икры во время инкубации являются на сегодняшний день наиболее актуальными направлениями исследований в области аквакультуры. Цель исследования состояла в оценке степени влияния растворов пероксида водорода разной концентрации на рост сапролегниевых микромицетов на яйцевых оболочках эмбрионов белуги (Huso huso) и на ход ее эмбрионального развития.Методика исследованийИсследования проводили на базе научно-экспериментального комплекса аквакультуры «БИОС» Волжско-Каспийского филиала Всероссийского научно-исследовательского института рыбного хозяйства и океанографии (ФГБНУ «ВНИРО» («КаспНИРХ»)). Объектом исследований являлись оплодотворенные ооциты и развивающиеся эмбрионы белуги (Huso huso). Экспериментальные работы вели в период инкубации белуги (Huso huso) в инкубационных аппаратах типа «Осетр» в условиях замкнутого водоснабжения (рН = 8,1 ± 0,5; t = 14,9 ± 0,8 °С) в течение семи суток. Обработку экспериментальными раствора-ми осуществляли в два этапа, на 21–22 и 27–28 стадии развития [9, 10], методом кратко-временных лечебных ванн [11]. Оценку степени воздействия растворов пероксида водорода на эмбриональное развитие белуги (Huso huso) проводили по следующим показателям: количество оплодотворенных ооцитов, количество выживших эмбрионов и вылупившихся предличинок [12], количество эмбрионов, зараженных микромицетами сем. Saprolegniaceae, и аномально развивающихся особей [3]. Показатели определяли с использованием микроскопа «Биомед МС-1 Стерео». Количество вылупившихся предличинок определяли весовым методом [12]. Результаты подвергали статистической обработке с использованием программы Microsoft Excel. Схема проводимых экспериментальных работ представлена в таблице. Схема экспериментальных работScheme of the experimental worksВидХимическое веществоКонцентрация раствора, %Экспозиция, минБелуга (Huso huso)Контроль*00,00Пероксид водорода0,0510,000,1010,000,2010,000,3010,000,4010,00*Контрольная группа с икрой, которая не подвергается обработке. Для инкубирования и обработки эмбрионов белуги (Huso huso) были использованы 12 вкладышей аппарата «Осетр», соответствовавших опытным группам. В двух контрольных группах инкубируемые эмбрионы не обрабатывали экспериментальными растворами. Каждая опытная группа была в двух повторностях.Для проведения исследований были использованы растворы пероксида водорода разных концентраций: от 0,05 до 0,40 %. Пероксид водорода, являясь сильным окислителем, обладает бактерицидными свойствами. В Европе используется для обработки икры форели [8]. Эмбрионы белуги обрабатывали с одинаковой экспозицией – 10 мин. Растворы готовили путем разбавления маточного раствора до необходимой концентрации. Гистологический анализ развивающихся эмбрионов проводили в лаборатории молекулярной генетики и физиологии Волжско-Каспийского филиала ФГБНУ «ВНИРО» («КаспНИРХ»). Были отобраны пробы (по 10 эмбрионов в яйцевых оболочках в одной пробе) после оплодотворения на разных стадиях развития. Гистологические исследования проводили стандартными гистологическими методами [13]. При изготовлении гистологических препаратов использовали окраску гематоксилин-эозином и кислым фуксином с доокраской по Маллори. Просмотр препаратов проводился под микроскопом OLYMPUS ВХ40. Фотографии изготовили с помощью цифровой камеры-оку-ляра для микроскопа ДСМ500.Результаты Важным показателем для оценки степени влияния того или иного фактора на эмбриональное развитие является выживаемость эмбрионов. При анализе результатов следует учитывать, что выживаемость эмбрионов снижается в ходе развития, но обработка растворами химических веществ может спровоцировать их гибель, поэтому необходимо выбрать оптимальную концентрацию раствора, которая не будет провоцировать увеличение смертности в эмбриональный период развития. На рис. 1 показана динамика выживаемости эмбрионов белуги (Huso huso) в соответствии с экспериментальными группами. Рис. 1. Количество выживших эмбрионов белуги (Huso huso) на разных стадиях развития в контрольной и опытных группахFig. 1. The number of beluga (Huso huso) survived embryos at different stages of development in the control and experimental groups Практически во всех опытных группах, кроме опытной группы с использованием 0,05 %, регистрировали снижение выживаемости от 18–19 к 28–29 стадии развития. При этом на фоне значений выживаемости в контрольной группе (28–29 стадия развития – 60,00 ± 0,00 %) максимальная выживаемость эмбрионов отмечена в группе с применением 0,05 %-го раствора (28–29 стадия развития – 73,50 ± 2,50 %), минимальная – с 0,40 %-м раствором (28–29 стадия развития – 7,50 ± 0,50 %). Рассчитанный по показателям выживаемости эмбрионов на 28–29 стадиях развития коэффициент аппроксимации (R2) стремится к единице. Это подтверждает предположение о том, что повышение концентрации растворов пероксида водорода оказывает негативное влияние на выживаемость.Обработка инкубируемой икры растворами химических веществ может влиять на количество аномально развивающихся эмбрионов. Количество аномально развивающихся эмбрионов белуги (Huso huso) в контрольной и опытной группах показаны на рис. 2. Рис. 2. Количество аномально развивающихся эмбрионов белуги (Huso huso) на разных стадиях развития в контрольной и опытных группахFig. 2. Number of abnormally developing embryos of beluga (Huso huso)at different stages of development in the control and experimental groups На каждом этапе эмбрионального развития отмечены разные виды аномалий. Если на 18–19 стадии развития регистрируются нарушения, связанные с гаструляцией (формирование тела эмбриона при открытом бластопоре), на 28–29 стадиях отмечены морфологические изменения (искривление и укорочение тела эмбриона). Минимальное количество аномально развивающихся эмбрионов на 28–29 стадии развития отмечено в опытных группах с применением 0,05 %-го раствора пероксида водорода (2,50 ± 2,50 %), а максимальное – с 0,40 %-м раствором (5,50 ± 1,90 %). Коэффициент аппроксимации (R2), рассчитанный по показателю количества аномально развивающихся эмбрионов на 28–29 стадиях развития, стремится к единице, подтверждая предположение о том, что повышение концентрации растворов пероксида водорода приводит к увеличению количества аномально развивающихся эмбрионов.Помимо вышеперечисленных аномалий при воздействии растворов химических веществ на яйцевые оболочки эмбрионов белуги (Huso huso) были отмечены нарушения в их строении, которые подтверждаются результатами гистологического анализа.Изменения в структуре оболочек эмбрионов белуги (Huso huso) были отмечены и в контрольной группе, которая не подвергалась воздействию экспериментальных растворов. У некоторых эмбрионов выявлено локальное разрушение студенистой оболочки, отслоение оболочек (рис. 3). абРис. 3. Фрагменты оплодотворенной икры белуги (Huso huso) контрольной группы (окраска кислым фуксином с докраской по Маллори): а – 18–19 стадия развития (ув. 10 × 10); б – 28–29 стадия развития (ув. 4 × 10): 1 – расслоение оболочек, отслоение студенистой оболочки; 2 – зачаток хорды; 3 – целом*, вторичная полость тела); 4 – содержимое икрыFig. 3. Fragments of fertilized beluga (Huso huso) eggs of the control group (staining with sour fuchsin with finishing paint after Mallory): a – 18-19 stages of development (magnification 10 × 10); б – 28-29 stage of development (mag. 4 × 10): 1 – flaking of shells, exfoliation of gelatinous shell;2 – primordium of the notochord; 3 – coelome; 4 – roe content В опытной группе с применением 0,05 %-го раствора пероксида водорода отмечено отслоение оболочек, а также полости в содержимом икры непосредственно под оболочками, заполненными веществом невыясненной природы (рис. 4). абРис. 4. Фрагменты оплодотворенной икры белуги (Huso huso), обработанной 0,05 %-м раствором пероксида водорода (окраска кислым фуксином с докраской по Маллори): а – 18–19 стадия развития (ув. 4 × 10); б – 28–29 стадия развития (ув. 10 × 10): 1 – отслоение оболочки; 2 – полости в содержимом икры, заполненные веществом невыясненной природы Fig. 4. Fragments of fertilized eggs of beluga (Huso huso) treated with 0.05% hydrogen peroxide solution (Staining with acid fuchsin with coloring after Mallory): a – 18-19 stage of development (mag. 4 × 10); б – 28-29 stage of development (mag. 10 × 10): 1 – shell exfoliation; 2 – cavities in the roe content filled with an uncleared substance У эмбрионов опытных групп с использованием 0,10 %-го раствора пероксида водорода отмечено расслоение и отслоение оболочек, образование полостей в содержимом икры (рис. 5). абРис. 5. Фрагменты оплодотворенной икры белуги (Huso huso), обработанной 0,10 %-м раствором пероксида водорода (окраска кислым фуксином с докраской по Маллори): а – 18–19 стадия развития (ув. 4 × 10); б – 28–29 стадия развития (ув. 4 × 10): 1 – отслоение оболочки; 2 – полости в содержимом икрыFig. 5. Fragments of fertilized beluga (Huso huso) roe treated with 0.10% hydrogen peroxide solution (stained with acid fuchsin with Mallory's finish): a – 18-19 stage of development (mag. 4 × 10); б – 28-29 stage of development (mag. 4 × 10):1 – shell exfoliation; 2 – cavities in the roe content При обработке икры 0,20 %-м раствором пероксида водорода отмечено образование вакуолей, заполненных содержимым невыясненной природы, разрывы и отслоение оболочки от формирующегося эмбриона (рис. 6). абРис. 6. Фрагменты оплодотворенной икры белуги (Huso huso), обработанной 0,20 %-м раствором пероксида водорода (окраска кислым фуксином с докраской по Маллори):а – 18–19 стадия развития (ув. 4 × 10); б – 28–29 стадия развития (ув. 4 × 10): 1 – отслоившаяся оболочка; 2 – вакуоль с содержимым невыясненной природы; 3 – полость в содержимом икрыFig. 6. Fragments of fertilized beluga (Huso huso) roe treated with 0.20% hydrogen peroxide solution (acid fuchsin staining with Mallory's finish):a – 18-19 stage of development (mag. 4 × 10); б - 28-29 stage of development (mag. 4 × 10):1 – exfoliated shell; 2 – vacuole with unclear content; 3 – cavity in the roe content В опытных группах с применением 0,30 %-го раствора пероксида водорода отмечено отслоение оболочек от содержимого икры, расслоение студенистой оболочки и желточных оболочек (рис. 7). абРис. 7. Фрагменты оплодотворенной икры белуги (Huso huso), обработанной 0,30 %-м раствором пероксида водорода (окраска кислым фуксином с докраской по Маллори): а – 18–19 стадия развития (ув. 4 × 10); б – 28–29 стадия развития (ув. 40 × 10): 1 – отслоение оболочки; 2 – расслоение желточных оболочек Fig. 7. Fragments of fertilized beluga (Huso huso) roe treated with a 0.30% hydrogen peroxide solution (acid fuchsin staining with Mallory's finish):a – 18-19 stage of development (mag. 4 × 10); б – 28-29 stage of development (mag. 40 × 10):1 – shell exfoliation; 2 – delamination of the vitelline membranes При обработке инкубируемой икры 0,4 %-м раствором пероксида водорода отмечены следующие аномалии: отслоение оболочек от содержимого икры, их разрывы, расслоение студенистой и желточной оболочек, образование вакуолей с веществом невыясненной природы (рис. 8). абРис. 8. Фрагменты оплодотворенной икры белуги (Huso huso), обработанной 0,40 %-м раствором пероксида водорода (окраска кислым фуксином с докраской по Маллори): а – 18-19 стадия развития (ув. 4×10); б – 28-29 стадия развития (ув. 10×10): 1 – отслоение оболочки; 2 – разрывы оболочки; 3 – вакуоль, заполненная содержимым невыясненной природы; 4 – расслоение оболочек Fig. 8. Fragments of fertilized beluga (Huso huso) roe treated with 0.40% hydrogen peroxide solution (acid fuchsin staining with Mallory's finish): a – 18-19 stage of development (mag. 4 × 10); b - 28-29 stage of development (mag. 10 × 10): 1 – detachment of the shell; 2 – shell ruptures;3 – vacuole filled with unclear contents; 4 – shell delamination Основным показателем, характеризующим эффективность использования растворов пероксида водорода, является степень заражения эмбрионов. Количество зараженных сапролегниевыми микромицетами эмбрионов представлено на рис. 9. Рис. 9. Количество зараженных эмбрионов белуги (Huso huso) на разных стадиях развития в контрольной и опытных группахFig. 9. Number of infected beluga (Huso huso) embryosat different stages of development in the control and experimental groups В результате обработки инкубируемой икры белуги растворами пероксида водорода заражение сапролегниевыми микромицетами удалось снизить в опытной группе с использованием 0,05 %-го раствора (на 34–35 стадиях развития – 5,50 ± 3,50 %). В опытной группе с применением 0,10 %-го раствора (35,50 ± 4,50 %) также отмечено снижение заражения относительно значений в контрольной группе (55,50 ± 0,01 %). Коэффициент аппроксимации (R2), рассчитанный по показателю количества зараженных эмбрионов на 28–29 стадиях развития, не стремится к единице, следовательно, повышение концентрации растворов пероксида водорода не оказывает влияние на количество зараженных эмбрионов. Таким образом, повышение концентрации растворов для обработки эмбрионов белуги не приводит к снижению заражения, т. к. высокие концентрации губительно действуют на развивающиеся эмбрионы, снижая выживаемость. Как следствие, в опытных группах увеличивалось количество мертвой икры, которая являлась легкодоступным субстратом для микромицетов, что приводило к увеличению заражения. Использование 0,05 %-го раствора пероксида водорода приводило к снижению заражения инкубируемых эмбрионов, т. к. данная концентрация не приводила к их гибели и являлась достаточной для подавления роста сапролегниевых микромицетов. В результате инкубации эмбрионов белуги были получены предличинки. Их количество является показателем эффективности проведенных обработок растворами пероксида водорода. Количество полученных предличинок в контрольной и опытной группах показано на рис. 10. Рис. 10. Количество полученных предличинок белуги (Huso huso) в результате инкубации в контрольной и опытной группахFig. 10. Number of beluga (Huso huso) prelarvae obtainedafter incubation in the control and experimental groups Максимальное количество предличинок было получено в опытной группе с использованием 0,05 %-го раствора пероксида водорода (43,70 ± 1,50 %), что больше значений в контрольной группе (27,20 ±± 1,90 %). Минимальное количество свободных эмбрионов получено при применении 0,40 %-го раствора пероксида водорода (0,05 ± 1,80 %).ОбсуждениеПо результатам исследования установлено, что максимальное ингибирующее действие на рост микромицетов сем. Saprolegniaceae оказывает раствор пероксида водорода концентрацией 0,05 %. Этот вывод подтверждается экспериментальными данными. Выживаемость эмбрионов в контрольной группе соответствовала нормативу (60 %) [14], тогда как в опытной с использованием 0,05 %-го раствора превышала значение нормативного показателя на 13,5 % и составила 73,50 ± 2,50 %.Количество аномально развивающихся эмбрионов, согласно [10], при использовании качественного рыбоводного материала не должно превышать 14 %. Однако использование химических веществ при обработке инкубируемой икры может привести к увеличению аномалий у развивающихся эмбрионов. В ходе экспериментальных работ отмечено снижение количества аномалий во всех опытных группах от 18–19 к 28–29 стадии развития, а также смена качественного состава аномалий. Если на 18–19 стадии развития (период гаструляции) и на 24–25 стадии (период нейруляции) регистрировали формирование тела эмбриона при открытом бластопоре, то к 28–29 стадии развития основными видами аномалий стали морфологические (искривление и укорочение тела эмбриона). При этом с увеличением концентрации растворов пероксида водорода количество аномалий возрастало, но не превышало 6 %, что говорит о хорошем качестве половых продуктов производителей. Минимальное количество аномалий регистрировали при использовании 0,05 %-го раствора пероксида водорода (2,50 ± 2,50 %). Гистологический анализ показал, что изменения в оболочках были и в контрольной, и в опытных группах, но степень проявления данных повреждений увеличивалась с возрастанием концентрации растворов.Заражение сапролегниевыми микромицетами может достигать более 50 % [15], а при отсутствии должных лечебно-профилактических мероприятий вызывает 100 % гибель эмбрионов [16]. При использовании 0,05 %-го раствора пероксида водорода заражение эмбрионов на 34–35 стадии развития (перед вылуплением предличинок) составило 5,50 ± 3,50 %, что значительно ниже значений в контрольной (55,50 ± 0,01 %) и других опытных группах. Максимальное количество предличинок белуги (Huso huso), полученных в результате инкубации, регистрировали в опытной группе с использованием 0,05 %-го раствора пероксида водорода (43,70 ± 1,50 %), что является важным показателем эффективности использования данного химического вещества. ЗаключениеВ соответствии с полученными результатами можно сделать вывод: наиболее эффективным является 0,05 %-й раствор пероксида водорода с экспозицией 10 мин: данный раствор подавляет рост сапролегниевых микромицетов у эмбрионов белуги в ходе инкубации, при этом не оказывает негативного влияния на развитие и выживаемость эмбрионов.