Введение Красноклешневый австралийский рак Cherax quadricarinatus (Von Martens, 1868) является популярным объектом пресноводной аквакультуры [1]. Пресноводный десятиногий ракообразный стал важным объектом аквакультуры в нескольких странах мира из-за питательной ценности и экономической целесообразности выращивания. Объемы производства австралийского рака в Австралии – около 400 т/год, в Мексике – 50 т/год, в Белизе, Панаме и США – около 10 т/год. Широкое производство развернуто в Эквадоре, Марокко и в Испании, но точные объемы производств неизвестны [2]. Технологии выращивания данного объекта зависят от основных фондов рыбоводных предприятий, квалификации специалистов с необходимыми знаниями и опытом в области сельского и рыбного хозяйства, работающих в области культивирования нерыбных объектов [3]. Производство австралийских красноклешневых раков во многих странах рассчитано, прежде всего, на распространение продукции внутри страны, но уже в течение ряда лет наблюдается экспортный спрос на этот объект. Но в технологии выращивания красноклешневых раков имеется ряд моментов, требующих уточнений, а именно предложений по составу рецептуры комбикормов (стартовых, продукционных), оказывающему значительное влияние на улучшение физиологических и биохимических показателей и увеличение потенциала хозяйственных свойств объекта. Данная работа направлена на определение физиологических и биохимических показателей австралийских красноклешневых раков, выращиваемых в искусственных условиях при кормлении комбикормом по рецептуре, разработанной авторами исследования. Согласно исследованиям [4–10], объективным методом контроля физиологического состояния является определение общего белка гемолимфы как биоиндикатора условий выращивания и подсчет клеток гемолимфы (общий и дифференциальный). Цель исследования – дополнить общую характеристику физиологического состояния австралийских красноклешневых раков гематологическими и биохимическими показателями, а также гемоцитарной формулой (гемограмма) [11, 12]. Материалы и методы исследования Экспериментальные работы проводили на базе Инновационного центра «Биоаквапарк – НТЦ аквакультуры» ФГБОУ ВО «Астраханский государственный технический университет». В качестве объектов исследования использовались особи австралийских красноклешневых раков Cherax quadricarinatus (Von Martens, 1868) рода Cherax. При выращивании ракообразные содержались в рыбоводных емкостях объемом 400 л, оснащенных укрытиями, при разреженной плотности посадки, с оборотной водоочисткой и подогревом воды. Контроль за гидрохимическими показателями водной среды проводили ежедневно в соответствии с общепринятыми гидрохимическими методами. Температура воды составила +27,0 °С, содержание кислорода – 7,4–8,2 мг/л, соблюдался режим освещения «день/ночь». Выращивание производили на рецептуре комбикорма, разработанной авторами [13–18], общий состав экспериментальной рецептуры представлен компонентами растительного происхождения (пшеничная мука, соевая мука, мука из тыквы, морковь, укроп), животного происхождения (рыбная и мясокостная мука, гаммарусы и дафнии), минеральными веществами (мел и минеральный премикс), жировыми компонентами (подсолнечное масло и рыбий жир), дополнительным компонентом (закрепитель гранул). Физиологическое состояние выращиваемых объектов оценивалось по биохимическим показателям [19–22], отбор гемолимфы проводился in vivo по указаниям [23], из вентрального синуса прижизненно с сохранением здоровья, с соблюдением мер асептики и антисептики. Измерение оптической плотности экспериментальных проб проводили при помощи спектрофотометра Unico 2100. Изучение наиболее мелких деталей на гистологических препаратах гемолимфы производили с помощью электронного микроскопа Olympus (Япония). Гемоцитарную формулу процентного соотношения различных типов гемоцитов определяли по мазкам гемолимфы австралийских красноклешневых раков. Мазки гемолимфы готовили при помощи фиксатора-красителя фирмы «Ольвекс-диагностикум» (Россия), используя метод Май-Грюнвальда. Идентификацию гемоцитов проводили по стадиям их цитогенеза, оценивая дифференциальным подсчетом 4-х типов клеток. Для сравнительного анализа гемоцитарной формулы гемолимфы австралийских раков использовали данные по речным ракам из литературных источников [23, 24]. В ходе экспериментальной работы полученные данные статистически обработали методом вариационной статистики с использованием программы Microsoft Excel 2016. При расчете применили t-критерий Стьюдента, достоверными считались различия показателей при р < 0,05. Результаты исследований Исследованиями установлено, что при выращивании австралийских раков сбалансированный комбикорм, отвечающий физиологическим потребностям объекта, удовлетворительно отражается на показателе темпа роста и уровне белка гемолимфы. Физиологические и биохими-ческие показатели гемолимфы раков, выращенных на экспериментальном комбикорме, пред-ставлены в табл. 1. Таблица 1 Биотехнологические показатели выращивания Cherax quadricarinatus Показатель Значение Условия содержания Объем емкости, м3 4 Уровень воды, см 70 рН 7,2 О2, мг/л 8,1 Кормление, раз/сут 2 Плавучесть используемого корма отрицательная (тонущие) Период выращивания, сут 120 Рыбоводно-биологические показатели Абсолютный прирост, г 75,6 Кормовой коэффициент 0,9 Физиолого-биохимические показатели Общий белок, г/л 40,8 + 4,5 Холестерин, ммоль/л 3,2 ± 0,6 Бета-липопротеиды, г/л 0,8 ± 0,2 Выживаемость, % 80 В результате анализа гемолимфы ракообразных установлено, что содержание общего белка составило 40,8 ± 4,5 г/л. Высокий уровень общего белка как биоиндикатора свидетельствует о качественных условиях выращивания, повышенном уровне обмена веществ, а также о достаточной подготовленности генеративного обмена у особей австралийских раков. Поступление источников липидов отражается на показателе холестерина в гемолимфе у ракообразных, что впоследствии влияет на статус липидного обмена организма. Холестерин участвует в образовании половых гормонов, подготавливает производителей к нересту, увеличивает плодовитость. Также холестерин улучшает стрессоустойчивость, формируя естественную реакцию организма на стресс, стимулирует выделение адренокортикотропина, который, в свою очередь, обеспечивает синтез и секрецию кортикоидных гормонов (кортизола, кортизона, кортикостерона) [25]. О неудовлетворительном состоянии организма свидетельствует показатель уровня холестерина в гемолимфе выше 3,5 г/л, указывая на воздействие стрессирующих факторов среды и патологию. В нашем эксперименте содержание холестерина в гемолимфе составило у австралийских раков 3,2 ± 0,6 ммоль/л, что находится в пределах референтных значений. Уровень концентрации беталипопротеидов менее 0,5 г/л и более 6 г/л свидетельствует о резорбировании половых продуктов. С патологичным уровнем бета-липопротеидов в гемолимфе производители имеют нежизнеспособную икру, т. к. в процессе ее формирования отмечаются изменения фракционного состава белков и соотношения липидов, которые переносятся в икру бета-липопротеидами. В нашем эксперименте этот показатель составил 0,8 ± 0,2 г/л, концентрация бета-липопротеидов находилась в пределах референтных значений. На втором этапе экспериментальной работы исследовали гемограмму, оценка гемоцитарной формулы проводилась по дифференциальному подсчету 4-х типов гемоцитов (ГЦ) (рис. 1). Рис. 1. Гемоциты Cherax quadricarinatus: 1 – агранулоцит; 2 – полугранулоцит; 3 – гранулоцит; 4 – прозрачная клетка Оптическое микроскопирование и дифференцировку проводили с учетом характеристики грануляции протоплазмы и размера клеток (рис. 2). а б в г Рис. 2. Нативные форменные элементы гемолимфы Cherax quadricarinatus: а – агранулоцит; б – полугранулоцит; в – гранулоцит; г – прозрачная клетка Агранулоциты (ГЦ I). У австралийского рака, судя по диаметру клеток, это не самые малые гемоциты (табл. 2), по величине занимают 3 место среди форменных элементов гемолимфы. Таблица 2 Линейные размеры гемоцитов Типы гемоцитов Диаметр, мкм (М ± m) Прозрачная клетка 103,64 ± 0,6 Полугранулоцит 93,87 ± 0,1 Агранулоцит 86,7 ± 0,1 Гранулоцит 67,08 ± 0,2 *Увеличение 60 × 0,90. У речных раков гемоциты этого типа имеют сферичную форму и малые размеры, содержат небольшое количество крошечных цитоплазматических включений. Гемоциты этого типа дольше других клеток сохраняются на стекле в неизменном виде [24]. Образцы исследовались при увеличении 60 × 0,90, диаметр агранулоцитов варьирует от 85 до 90 мкм (рис. 3). а б в г Рис. 3. Нативные форменные элементы гемолимфы (Cherax quadricarinatus) с обозначением диаметра форменных элементов (увеличение 60 × 0,90): а – агранулоцит; б – полугранулоцит; в – гранулоцит; г – прозрачная клетка Полугранулоциты (ГЦ II) у австралийских раков исследовались при увеличении микро-скопа 60 × 0,90, диаметр полугранулоцитов варьирует от 90 до 95 мкм, среднее значение составляет 93,87 ± 0,1. Гемоциты этого типа более крупные по сравнению с другими форменными элементами гемолимфы. Их цитоплазма заполнена меньшим количеством микроскопических лучепреломляющих гранул. Также наблюдаются клетки веретенообразной формы с расположенным по центру ядром. Цитоплазма ГЦ II клеток на стекле быстро разрушается, а через 35 мин они становятся трудно отличимыми от ГЦ I. Гранулоциты (ГЦ III). У австралийских пресноводных раков это самые малые гемоциты – диаметр гранулоцитов варьирует от 65 до 78 мкм. Среднее значение составляет 67,08 ± 0,2 мкм. Их цитоплазма заполнена многочисленными и крупными гранулами, лучепреломление высокое. По данным других авторов, у речных раков исследуемые клетки ГЦ III являются самыми крупными клетками гемолимфы и достигают больших размеров [24]. Прозрачные клетки (ГЦ IV). Диаметр прозрачных клеток у австралийских раков варьирует от 85 до 120 мкм. Среднее значение составляет 103,64 ± 0,6 мкм, таким образом, у австралийских раков это самые крупные клетки. При оптическом микроскопировании на стекле ядра клеток ГЦ IV не просматриваются из-за большого количества цитоплазмы. В табл. 3 представлена гемоцитарная формула австралийских красноклешневых раков. Таблица 3 Гемоцитарная формула Cherax quadricarinatus Показатель Значение, М± m Агранулоцит 5,0 ± 0,1 Полугранулоцит 15,0 ± 0,6 Гранулоцит 57,0 ± 1,2 Прозрачная клетка 23,0 ± 1,8 Процентное соотношение гранулоцитов, стабильно встречающихся в гемолимфе, а также прозрачных клеток составило 57,0 ± 1,2 и 23,0 ± 1,8 % соответственно. У австралийского рака нативные форменные элементы гемолимфы встречались редко – агранулоциты 5,0 ± 0,1 %, полугранулоциты 15,0 ± 0,6 %, что подтверждено статистически. Таким образом, в результате изучения гемограммы были выявлены наиболее стабильные формы: у австралийских раков – гранулоциты, процентное соотношение которых по отношению к другим форменным клеткам составило более 50 %, и прозрачные клетки, процентное соотношение которых по отношению к другим форменным клеткам составило более 20 %; промежуточную встречаемость занимают полугранулоциты – до 15 %; редко встречаемой группой оказались агранулоциты – около 5 %. В части видовой специфичности в процентном соотношении клеточных элементов гемолимфы были замечены различия, так, у австралийских раков агранулоциты встречались очень редко (5,0 %) и не на всех мазках, в отличие от пресноводных раков (40,0 %) [23] (рис. 4). Рис. 4. Соотношение форменных клеток гемолимфы Полугранулоциты занимают промежуточное положение у обоих видов, но у широкопалых речных раков данный форменный элемент встречался чаще (р > 0,05). Преобладающими клеточными элементами гемолимфы у австралийских раков были гранулоциты (57,0 %), их было значительно больше [23], чем у речных раков (27,8 %). Доля прозрачных клеток у австралийских раков составила 23 %, у речных раков этот форменный элемент гемолимфы меньше в 3 раза и составляет 8 %. Результаты сравнительного анализа клеточного состава гемолимфы австралийского красноклешневого рака Cherax quadricarinatus (Von Martens, 1868) демонстрируют таксономическую специфичность данного представителя пресноводной аквакультуры. Заключение Сбалансированный комбикорм при выращивании австралийских раков отвечал физиологическим потребностям объекта, что удовлетворительно отразилось на показателе темпа роста. Также был установлен высокий уровень биоиндикатора качества условий содержания – общего белка гемолимфы. При обзоре клеточных элементов гемолимфы по морфологическим признакам выделили четыре группы гемоцитов – агранулоциты (ГЦ I), полугранулоциты (ГЦ II), гра-нулоциты (ГЦ III) и прозрачные клетки (ГЦ IV). У австралийских раков агранулоциты встреча-лись очень редко и не на всех мазках, промежуточное положение занимают полугранулоциты, преобладающими клеточными элементами гемолимфы у австралийских раков являются грану-лоциты, что свидетельствует о таксономической специфичности вида и качественно отличает процентное соотношение клеточных элементов гемолимфы от такового у представителей речных раков.