Ресничные инфузории Tetrahymena pyriformis - одноклеточные эукариотические организмы, характерной особенностью которых является интенсивный метаболический процесс, позволяющий им легко адаптироваться к условиям внешней среды. По ряду основных метаболических циклов инфузории сходны с клетками высших организмов, что обусловливает их использование в разнообразных биологических и медицинских исследованиях [1, 2]. Кроме того, очевидны преимущества использования простейших относительно применения теплокровных животных для биологического тестирования пищевых продуктов. К ним относят отсутствие существенных материальных затрат на содержание тест-организмов и проведение эксперимента, отсутствие проблем этики, возможность проведения большой серии экспериментов, малый жизненный цикл и высокая скорость размножения инфузорий, простота, компактность и безвредность данного метода биологического тестирования, возможность мобильного использования метода как в лабораториях, так и на предприятиях [3, 4]. В пищевой промышленности инфузория T. pyriformis используется как индикаторный организм для оценки токсичности различных веществ, например пищевых добавок, токсичных элементов, антибиотиков и др., биологической активности БАВ, безвредности, степени усвоения пищевого продукта и его биологической ценности [4-7]. Быстрый рост популяции и генетическая однородность позволяют выявить групповые специфические изменения аллергенного, тератогенного и мутагенного характера, обеспечивая тем самым статистическую достоверность наблюдаемой тест-реакции [8]. Способность T. pyriformis использовать интактные белки в качестве питательного субстрата имеет прикладное значение в оценке биологической ценности пищевого продукта, причем коэффициент корреляции результатов экспериментов при сравнении инфузорий T. pyriformis и белых крыс составляет 0,93-0,98 и оценивается учеными как высокий [9]. Биологическую доступность белков пищевого продукта при этом характеризует скорость протекания процессов жизнедеятельности индикаторного организма в зависимости от количества и качества пищевого объекта, что может быть оценено по приросту числа инфузорий по дням опыта [8]. Целью наших исследований явилось обоснование применения экспресс-метода биологической оценки пищевого продукта с использованием ресничной инфузории Tetrahymena pyriformis для определения технологических параметров термической обработки продукта, а также оценка биологической ценности рыбного кулинарного продукта. В соответствии с поставленной целью предполагалось решение следующих задач с использованием метода биотестирования: - исследование относительной биологической ценности пищевых белковых гелей на основе мышечной ткани макруруса малоглазого при различных температурных режимах термической обработки; - исследование биологической ценности рыбной кулинарной продукции с различными белковыми обогатителями. Объекты и методы исследования Объектом исследования явились пищевые белковые гели из макруруса малоглазого (Albatrossia pectoralis) и кулинарные продукты на их основе. Для образования гелевой структуры использовали разработанный ранее бинарный структурообразователь, состоящий из желатина и уксуснокислого раствора хитозана. Массовая доля каждого компонента при этом составляла 2 %. Готовые кулинарные продукты представляли собой структурированные дисперсные системы из гомогенной мышечной ткани (студни), основным сырьем в которых являлся макрурус малоглазый (ГОСТ 17660-97). Вспомогательными материалами служили желатин пищевой марки П-11 по ГОСТ 11293-89, хитозан пищевой высокомолекулярный (ТУ 9289-067-00472124-03), уксусная кислота (ГОСТ 55982-2014), соль пищевая (ГОСТ Р 51574-2018). Белковыми обогатителями служили горбуша, минтай, треска в соответствии с ГОСТ 1168-86. Для подготовки образцов рыбной кулинарной продукции использовали полиамидную непроницаемую барьерную оболочку (ТУ 2290-010-27147091-2000). Образцы белковых гелей и кулинарных продуктов на их основе подготавливали следующим образом: рыбу размораживали до температуры -5 °С, разделывали на филе, измельчали на кусочки 20 мм, затем проводили тонкое измельчение до получения однородной гомогенной массы. В процессе тонкого измельчения вносили бинарный структурообразователь - подготовленный 2 %-й уксуснокислый раствор хитозана и сухой желатин. Затем образцы термически обрабатывали до заданной температуры в центре образца. Охлажденные образцы подвергали биотестированию. В качестве индикаторного организма использовали аксеническую культуру инфузории Tetrahymena pyriformis. Контрольными образцами в исследованиях служили пищевой белковый гель без термической обработки (сырой) и стандартный белок казеин. Кривые роста популяции инфузорий строили на основании стационарной фазы. Относительную биологическую ценность (ОБЦ) белковых гелей определяли как отношение числа клеток инфузорий, культивированных в средах с исследуемым продуктом, к количеству инфузорий, выросших в контрольной среде, выраженное в процентах. Коэффициент биологической активности (КБА) рассчитывали как отношение числа клеток индикаторного организма при переходе в стационарную фазу роста к продолжительности инкубации до перехода в стационарную фазу [10]. Коэффициент эффективности белка (КЭБ) определяли отношением числа инфузорий в 1 мл среды культивирования, содержащей исследуемый продукт, к количеству белка (мг/мл) в пробе, выраженным в процентах [11]. Статистическую обработку результатов исследования осуществляли на основе подсчета средних значений величин и стандартной средней ошибки. Результаты и их обсуждение Для обоснования температурных режимов тепловой обработки пищевых продуктов в настоящее время учеными и практиками применяется, в том числе, и экспресс-метод биологической оценки с использованием простейших [10, 12]. Биологическую доступность пищевого продукта характеризует скорость протекания процессов жизнедеятельности индикаторного организма под воздействием количества и качества пищевого объекта, что может быть оценено по приросту числа инфузорий по дням опыта [10]. Чем выше биологическая доступность продукта, тем лучше он усваивается и отмечается более интенсивный рост инфузорий на средах. На рис. 1 представлена динамика численности популяции T. pyriformis в среде культивирования, содержащей белковый гель из макруруса малоглазого и трески, полученный путем прогрева до заданной температуры в центре образца, скорость прогрева при этом была постоянной и составляла 2,0 ± 0,2 °С/мин. Рис. 1. Динамика численности популяции инфузорий T. pyriformis в среде культивирования, содержащей белковый гель, полученный при различных значениях температурной обработки Несмотря на нелинейный характер кривой роста, полученные данные позволяют определить динамику численности популяции в зависимости от температуры обработки образцов белкового геля. Наибольший рост клеток зафиксирован в среде, содержащей белковый гель из макруруса и трески, термическая обработка которого осуществлялась до температуры в центре продукта 45 °С. Известно, что при данной температуре начинают происходить денатурационные изменения белкового сырья, которые, в зависимости от степени, могут оказывать положительное влияние на перевариваемость продукта [13]. В диапазоне температур от 45 до 70 °С создаются благоприятные условия для развития эндогенной термофильной микрофлоры, которая, в свою очередь, подавляет жизнедеятельность популяции инфузории. Этим объясняется ниспадающий вид кривой роста. Однако с увеличением температуры от 70 до 85 °С интенсивность роста микрофлоры снижается, происходит ее дальнейшее подавление, в результате чего создаются условия, необходимые для питания индикаторного организма. Кроме того, в данном температурном диапазоне происходит деструкция молекул желатина, дальнейшее его растворение, позволяющее молекулам данного белка приобрести биологически доступную для питания инфузорий конформацию, что способствует их интенсивному росту. Также следует отметить, что именно при температуре 85 °С готовый продукт приобретает достаточно высокий уровень показателя биологической доступности, который составляет около 160 % по отношению к продукту без термической обработки (табл. 1). Таблица 1 Сравнительная характеристика биологической ценности белковых гелей в зависимости от температуры обработки Температура обработки продукта, °С Показатели биологической ценности ОБЦ, % КБА КЭБ, % 0 (без термообработки) 100,00 0,75 45,57 40 113,68 0,85 51,80 45 159,77 1,19 72,80 50 126,81 0,95 57,78 55 129,60 0,96 59,06 60 95,81 0,71 43,65 65 100,84 0,75 45,95 70 87,43 0,65 39,84 75 131,84 0,98 60,08 80 126,81 0,95 57,78 85 159,50 1,19 72,68 При расчете КЭБ учитывали содержание белка в пищевом белковом геле из макруруса малоглазого и трески, составляющее 12,57 ± 0,2 % г/100 г продукта. Согласно проведенным ранее исследованиям [14] произведено проектирование состава кулинарного продукта по типу студня, основным сырьем в котором является низкобелковый макрурус малоглазый. Для обогащения данного вида продукции белком предложено использовать такие объекты водных биологических ресурсов Тихоокеанского бассейна, как горбуша, минтай и треска. Их внесение позволит не только обогатить продукт белком, но и повысить содержание протеиногенных аминокислот. На рис. 2 представлены результаты биотестирования образцов кулинарного продукта из макруруса малоглазого (студня) без использования белковых обогатителей. Время культивирования Рис. 2. Динамика численности популяции T. pyriformis при культивировании на средах со студнем без белковых обогатителей Результаты биотестирования образцов кулинарной продукции из макруруса малоглазого с использованием белковых обогатителей выражены графически на рис. 3. а б в Рис. 3. Динамика численности популяции T. pyriformis при культивировании на средах со студнем, содержащим белковые обогатители: минтай (а); горбуша (б); треска (в) Как следует из полученных данных, на протяжении 4-х суток (96 ч) в средах, содержащих исследуемые образцы кулинарного продукта, наблюдается интенсивный рост числа клеток инфузорий. Дальнейшее снижение числа клеток в средах с образцами, содержащими минтай и треску, объясняется тем, что продукт обладает высокой усвояемостью, вследствие чего питательная среда истощается и становится неблагоприятной для дальнейшего культивирования индикаторного организма, тогда как в культивируемой среде, содержащей образец с горбушей в качестве обогатителя, рост клеток продолжился и на 6-е сутки, что свидетельствует о низкой скорости его переваривания для тест-организма. Следует отметить, что образец кулинарного продукта с минтаем показал более высокие значения роста числа клеток по сравнению со средой на основе студня из макруруса (см. рис. 2). Сравнительный анализ исследуемых образцов кулинарных продуктов показал, что студни из мышечной ткани макруруса малоглазого обладают более высокими показателями биодоступности и эффективности белка при сравнении с образцами, содержащими белковые обогатители. Однако данное явление обусловливает быстрое истощение питательной среды уже спустя 48 ч и, как следствие, гибель популяции T. pyriformis. Результаты определения показателей биологической ценности исследуемых рыбных кулинарных продуктов представлены в табл. 2. Таблица 2 Сравнительная характеристика биологической ценности рыбных студней в зависимости от применяемого белкового обогатителя Показатель биологической ценности Рыбный студень из макруруса без обогатителей из макруруса с треской из макруруса с минтаем из макруруса с горбушей ОБЦ, % 99,30 39,65 101,40 68,35 КБА 2,380 0,475 1,210 0,550 КЭБ, % 25,09 7,25 14,46 11,27 Содержание белка в продукте, г/100 г 9,10 12,57 16,13 13,94 Полученные данные позволяют сделать вывод о том, что белковый гель из макруруса малоглазого с минтаем, имеющий наибольшее значение ОБЦ, предпочтителен в качестве питательного субстрата для индикаторного организма, причем данный образец белкового геля имеет и наибольшее содержание белка из представленных. Заключение Обосновано применение экспресс-метода биологической оценки пищевого белкового геля и рыбного кулинарного продукта на его основе с использованием ресничной инфузории Tetrahymena pyriformis для определения технологических параметров обработки, а также проведена оценка биологической ценности рыбного кулинарного продукта. Исследованы показатели биологической ценности пищевых белковых гелей на основе мышечной ткани макруруса малоглазого при различных температурных режимах термической обработки. В ходе исследования выявлено, что наилучшим питательным субстратом для индикаторного организма T. pyriformis является пищевой белковый гель, температура обработки которого составила 45 и 85 °С. Однако температуры термообработки, составляющей 45 °С, недостаточно для обеспечения микробиологической безопасности продукта, а также набухания и растворения вносимого в состав студня желатина. Кроме того, при температуре 85 °С готовый продукт приобретает достаточно высокий уровень показателя биологической доступности, который составляет 160 % по отношению к продукту без термической обработки. Результаты определения показателей биологической ценности белковых гелей из макруруса малоглазого с использованием белковых обогатителей методом биологического тестирования позволили сделать вывод о том, что внесение минтая способствует большему обогащению продукта белком, повышению качества продукта и его биологической ценности в сравнении с белковыми гелями, где в качестве белковых обогатителей используются треска и горбуша. Таким образом, биотестирование с использованием простейших позволяет осуществить сравнительную оценку качества рыбной кулинарной продукции путем простого подсчета числа инфузорий по дням опыта в средах культивирования. Графический анализ полученных данных на протяжении жизненного цикла популяции T. pyriformis позволяет достаточно быстро и точно оценить жизнеспособность инфузорий, степень усвоения питательного субстрата и, таким образом, сделать выводы о биологической ценности продукта.