Введение Антропогенные загрязнения являются одним из главных факторов, оказывающих существенное негативное воздействие на водную среду. В частности, нефть и нефтепродукты - опаснейшие загрязнители водной среды. Аварийные разливы нефти и нефтепродуктов меняют условия обитания гидробионтов, тем самым нарушая многие естественные процессы и взаимосвязи. Из всего спектра нефтепродуктов наибольшую опасность представляют водорастворимые и диспергированные компоненты нефти [1-4]. Оценка степени загрязнения природной воды при аварийных разливах нефти и нефтепродуктов осложняется некоторыми особенностями водной среды и неоднородностью загрязнителя, мешающими объективной оценке степени загрязнения только методом количественного химического анализа (КХА). Во-первых, при равных показателях массовой концентрации нефтяные загрязнители, обладающие разным фракционным составом, оказывают разную степень токсического воздействия на живые организмы. По фракционному составу выделяют: бензиновые (лёгкие) фракции, керосиновые (средние) фракции, дизельные фракции, масляные (тяжёлые) фракции и мазут [5]. Во-вторых, нефтяные «пятна» обладают возможностью быстрого перемещения по акватории. Это обусловливает вероятность кратковременного контакта водных организмов с относительно большими концентрациями нефтепродуктов на очень больших территориях, что приводит к их последующей гибели уже в чистой воде. Это особенно характерно для зоопланктонных организмов. Так, при возрастании нефтяных загрязнений отмечается уменьшение численности и видового состава представителей отряда Cladocera (тип Crustacea), являющихся наиболее чуткими индикаторами загрязнения природной воды [1, 6]. Всё вышесказанное обусловливает необходимость изучения степени токсичности нефтепродуктов в воде не только методом КХА, но и методом биотестирования, позволяющим наиболее точно определить степень влияния загрязнителей непосредственно на живые организмы [7-9]. Целью исследования являлось изучение влияния токсичности различных фракций нефтепродуктов на физиологическую активность ракообразных (тип Crustacea) методом биотестирования. Для достижения цели решались следующие задачи: биотестирование нефтепродуктов различных фракций с серией разбавлений в культивационной воде; определение летальных и безопасных доз загрязнителей; проведение сравнительного анализа результатов эксперимента с выявлением корреляционной зависимости между содержанием углеводородов различных фракций в водной среде и количественными, качественными проявлениями физиологических признаков у тест-организмов. Материалы и методы исследования Биотестирование проводили в контролируемых лабораторных условиях, что позволило исключить влияние других факторов внешней среды. В качестве тест-объекта исследований был выбран вид Daphnia magna, Straus - представитель рода Daphnia, семейства Cladocera, отряда Cladocera. Для данного вида характерен стандартный набор следующих морфологических признаков. Тело - овальной формы, сжатое с боков, нечетко сегментировано на головной, грудной и брюшной отделы, заключено в прозрачный панцирь; голова не отделена выемкой от туловища, вытянутый передний край головного щита образует рострум. Антенны расположены под рострумом, служат для скачкообразного перемещения в толще воды. Имеются в наличии створки с дорсальным килем и хвостовой иглой, дорсальный край постабдомена - с выемкой. Грудные ножки и кишечник расположены на вентральной стороне тела между створками панциря. Биотестирование проводили на синхронизированной культуре дафнии (Daphnia magna, Straus) [8]. Каждую пробу и её разбавления ставили в трёх повторностях. Наблюдения за изменениями физиологического состояния тест-объекта в остром опыте и контроле проводили до истечения 96 часов. Для определения летальных и безвредных концентраций (ЛК и БК) применяли метод прямого подсчёта. В качестве поллютантов были использованы лёгкие или бензиновые фракции (бензин); средние или керосиновые фракции (керосин); дизельная фракция (дизельное топливо); тяжёлые или масляные фракции (машинное масло); нефтесодержащий отход с поверхности воды в месте аварийного разлива. Контроль качества оценки токсичности поллютантов в эксперименте проводили по определению чувствительности используемых тест-организмов к модельному эталонному токсиканту - калию двухромовокислому (K2Cr2O7). Диапазон концентраций модельного токсиканта, при действии которого в течение 24 часов гибнет 50 % дафний, составил 1,0-1,26 мг/дм3, что методически соответствует диапазону чувствительности тест-объекта (0,9-2,0 мг/дм3) нефтепродуктов [8]. Результаты исследований и их обсуждение В научной литературе существуют различные точки зрения на то, какой именно метод определения токсичности водной среды наиболее точен и эффективен: КХА, биотестирование или иные методы [1, 3, 8]. Поскольку углеводородные загрязнители могут иметь различный фракционный состав, их токсичность, соответственно, может значительно (на один-два порядка) отличаться при одних и тех же количественных показателях содержания поллютантов. Следовательно, нельзя конкретно определить только по количественному содержанию нефтепродуктов в воде (т. е. методом КХА), какая концентрация нефтепродуктов в водной среде является безопасной или токсичной. Обязательно необходимо учитывать влияние углеводородов непосредственно на водные организмы (например, используя метод биотестирования). Результаты, полученные нами в ходе эксперимента, полностью это подтвердили. Уже через 1 час после начала эксперимента ряд сходных физиологических изменений (кроме летального исхода) наблюдался у тест-организмов при разных концентрациях поллютантов (табл. 1). Анализ результатов эксперимента свидетельствует о том, что реакция тест-организмов на присутствие в воде углеводородов неоднозначна. Наибольший токсический эффект у тест-объекта через 1 час после начала опыта вызвали машинное масло и дизельное топливо. Проявление физиологических отклонений (всплытие на поверхность воды, кружение на боку, отсутствие характерных скачкообразных движений, затрудненность дыхания, отсутствие активного питания) у 100 % тест-организмов наблюдалось уже при концентрации 0,05 мг/дм3 (загрязнитель - машинное масло) и 2 мг/дм3 (загрязнитель - дизельное топливо). В отличие от воздействия прочих фракций, бензиновые фракции при концентрации 2-4 мг/дм3 вызывали оседание тест-объекта на дно сосуда. Таблица 1 Влияние содержания нефтепродуктов в пробах воды на физиологические признаки тест-объекта через 1 час после начала опыта Физиологические изменения Содержание нефтепродуктов в пробах воды, мг/дм3 Бензин Керосин Отход нефтепродуктов Дизельное топливо Машинное масло Всплытие на поверхность воды, кружение на боку у поверхности воды, антенны судорожно подергиваются или неподвижно прижаты к створкам раковины, отсутствие характерных скачкообразных движений 2,0-4,0 20,0 20,0 0,25 0,05 Залегание на дно сосуда, отсутствие характерных скачкообразных движений, редкие конвульсивные подергивания антенн, редкие поступательные движения с замиранием 4,0 - - - - Движения грудных ножек прерывистые, створки раковины малоподвижны, дыхание затруднено 2,0 20,0 20,0 0,25 0,05 Отсутствие активного питания, кишечник не заполнен при наличии корма в воде 2,0 20,0 20,0 0,25 0,05 Активные скачкообразные передвижения в толще воды, движения створок равномерные, дыхание и питание без отклонений от нормы 0,25 4,0 4,0 0,05 0,025 Через 48 часов после начала эксперимента сходные физиологические характеристики у тест-организмов (в том числе летальный исход) наблюдались при разных концентрациях поллютантов в воде. Наибольший токсический эффект у тест-организмов вызвали машинное масло, отход нефтепродуктов и дизельное топливо. Проявление физиологических отклонений (всплытие на поверхность воды, кружение на боку, отсутствие характерных скачкообразных движений, затрудненность дыхания, отсутствие активного питания) у 100 % тест-организмов наблюдалось уже при концентрации машинного масла 0,025 мг/дм3; отхода нефтепродуктов 0,025 мг/дм3 и дизельного топлива 0,25 мг/дм3. При концентрации в пробах воды машинного масла 0,05 мг/дм3 и дизельного топлива 0,25 мг/дм3 (табл. 2) у тест-организмов был выявлен 50 %-ный летальный исход (ЛК50). Таблица 2 Влияние содержания нефтепродуктов в пробах воды на физиологические признаки тест-объекта через 48 часов после начала опыта Физиологические изменения Содержание нефтепродуктов в пробах воды, мг/дм3 Бензин Керосин Отход нефтепродуктов Дизельное топливо Машинное масло Всплытие на поверхность воды, кружение на боку, антенны судорожно подергиваются или неподвижно прижаты к створкам раковины, отсутствие характерных скачкообразных движений, линька - 0,05 0,025 0,25 0,025 Движения грудных ножек прерывистые, створки раковины малоподвижны, дыхание затруднено, слабые поступательные движения с замиранием 2,0 0,05 0,025 0,25 0,025 Отсутствие активного питания, кишечник не заполнен при наличии корма в воде 2,0 0,05 0,025 0,25 0,025 Летальный исход 10 % Летальный исход 50 % Летальный исход 100 % 0,25 4,0 20,0 - - - - - 200 0,025 0,25 4,0 0,012 0,05 2,0 Активные скачкообразные передвижения в толще воды, движения створок равномерные, дыхание и питание без отклонений от нормы, летальный исход (˃ 10 %) не наблюдался 0,012 0,05 0,012 0,05 0,012 При увеличении времени экспозиции до 96 часов сходные физиологические изменения у тест-организмов также наблюдались при разных концентрациях загрязнителей в воде. На фоне общего увеличения летального исхода у выживших тест-организмов наблюдалась адаптация к воздействию поллютантов (табл. 3). Таблица 3 Влияние содержания нефтепродуктов в пробах воды на физиологические признаки тест-объекта через 96 часов после начала опыта Физиологические изменения Содержание нефтепродуктов в пробах воды, мг/дм3 Бензин Керосин Отход нефтепродуктов Дизельное топливо Машинное масло Адаптация к воздействию поллютанта, восстановление двигательных функций организма, нормализация процессов дыхания, питания - - 0,025-20,0 - 0,025-0,05 Летальный исход 10 % Летальный исход 50 % Летальный исход 100 % 0,25 2,0 20,0 0,25 2,0 20,0 0,012 0,05 20,0 0,025 0,25 4,0 0,012 0,025 0,05 Активные скачкообразные передвижения в толще воды, движения створок равномерные, дыхание и питание без отклонений от нормы, летальный исход (˃ 10%) не наблюдался 0,05 0,05 0,012 0,012 0,012 Наибольший токсический эффект у тест-организмов через 96 часов от начала постановки опыта вызвали машинное масло, отход нефтепродуктов и дизельное топливо. При концентрации поллютантов в пробах воды 0,025; 0,05 и 0,25 мг/дм3 соответственно у тест-организмов был выявлен 50 %-ный летальный исход. По степени и характеру токсического влияния на Daphnia magna, Straus отход, отобранный с места аварийного разлива на водном объекте, занял среднее положение между тяжёлыми и лёгкими фракциями нефтепродуктов. Вышеприведенные данные показали, что летальная токсическая концентрация (ЛК50) тяжёлых масляных фракций и отхода нефтепродуктов определялась при концентрациях в 10 раз более низких, чем ЛК50 фракции дизельного топлива и почти в 100 раз более низких, чем ЛК50 легких бензиновых и средних керосиновых фракций. Предел безвредных концентраций (БК10), растворённых и диспергированных в воде тяжёлых масляных фракций нефтепродуктов в 2 раза меньше, чем БК10 фракции дизельного топлива и в 20 раз меньше, чем БК10 лёгких бензиновых и средних керосиновых фракций нефтепродуктов. Анализируя временную динамику физиологической активности тест-организмов, следует отметить, что на общем фоне увеличения смертности Daphnia magna, Straus в пробах с тяжёлыми масляными фракциями и в пробах с отходом нефтепродуктов с места аварийного разлива у выживших тест-организмов наблюдалась адаптация к присутствию загрязнителя. Это выражалось в восстановлении двигательных функций, дыхания и питания у 50 % из наблюдаемых тест-организмов при концентрации масляных фракций 0,025 мг/дм3 и у 40 % тест-организмов при концентрации нефтесодержащего отхода 0,05 мг/дм3. Заключение Анализ экспериментальных данных показал, что максимальное воздействие на тест-объект Daphnia magna, Straus оказали тяжёлые масляные фракции нефтепродуктов, несмотря на то, что в пробах с масляными фракциями у ряда наблюдаемых тест-организмов наблюдалась адаптация к присутствию поллютанта. Сходные физиологические изменения у дафний под воздействием различных фракций нефтепродуктов наблюдались при разных концентрациях загрязнителей в воде. Летальные токсические концентрации (ЛК50) тяжёлых масляных фракций и отхода нефтепродуктов определялись при концентрациях в 10 раз более низких, чем ЛК50 фракции дизельного топлива и в 100 раз более низких, чем ЛК50 легких бензиновых и средних керосиновых фракций. Предел безвредных концентраций (БК10), растворённых и диспергированных в воде тяжёлых масляных фракций нефтепродуктов, в 2 раза меньше, чем БК10 фракции дизельного топлива и в 20 раз меньше, чем БК10 лёгких бензиновых и средних керосиновых фракций нефтепродуктов. По степени и характеру токсического влияния на тест-объект отходы нефтепродуктов, отобранные с места аварийного разлива на водном объекте, заняли среднее положение между тяжёлыми и лёгкими фракциями нефтепродуктов. В ходе биотестирования тест-объект Daphnia magna, Straus, представитель семейства Cladocera, проявил себя как чуткий индикатор загрязнения природной воды нефтепродуктами различных фракций и массовых концентраций. В заключение следует подчеркнуть, что решение проблемы оценки степени загрязнения водной среды углеводородами должно быть комплексным, т. е. для взаимоисключения методических недостатков необходимо использовать оба метода - КХА и биотестирование.