Введение Методы отбора «диких» производителей осетровых рыб на местах заготовки подробно изложены в соответствующих документах, методических пособиях и монографиях по рыбоводству [1, 2]. При отборе используются как морфологические признаки, так и специальные методы оценки функционального состояния репродуктивной системы самцов и самок осетровых рыб. Как в том, так и другом случае эти методы недостаточно эффективны по причине высокой степени неоднородности физиологического состояния рыб. В результате неточной диагностики манипуляции с производителями могут приводить к перезреванию рыб или индифферентному ответу на гипофизарную инъекцию. Особо актуальны проблемы оценки степени зрелости гонад у производителей осетровых, выращенных в установках замкнутого водоснабжения (УЗВ). В природных условиях динамика физиологических функций строго подчиняется сезонным изменениям параметров водной среды и колебаниям массы кормовых ресурсов. У производителей осетровых, содержащихся в УЗВ при постоянно высокой температуре воды и кормлении жирными кормами, происходит излишняя аккумуляция в гонадах липидных компонентов. Это препятствует их нормальному созреванию. Для изменения динамики обменных процессов в нужном направлении в УЗВ понижают температуру воды до 6 °С. В период «зимовки» активируется расход накопленных липидов и завершается созревание половых продуктов [3-6]. Вместе с тем, при любой рыбоводной технологии, отбор производителей представляет собой двухэтапный процесс, который начинается исключением из оборота рыб, неподходящих для воспроизводства, и завершается отбором производителей, способных положительно ответить на гормональную стимуляцию и дать качественные половые продукты. В период бонитировки помимо рыб, находящихся в III, III-IV и IV стадиях зрелости гонад (СЗГ), выделяют группы, имеющие начальные этапы формирования гонад и впервые созревающие. В современной градации СЗГ осетровых рыб наиболее информативной принято считать классификацию В. З. Трусова [7]. В международной практике используется шкала B. S. Conte с соавторами [8]. Шкала В. З. Трусова более дифференцирована по числу СЗГ (в частности, выделяются стадии II и IV). Это свидетельствует в пользу того, чтобы применять более тонкие биохимические методы тестирования стадий зрелости половых продуктов. В настоящее время в практике отбора производителей осетровых рыб используются такие методы, как биопсия, эндоскопия, инфракрасное сканирование, морфометрия и для завершающей диагностики степени зрелости их половых продуктов - биохимическое тестирование. Эти методы отличаются определенной степенью сложности применения и точности. Некоторые методы достаточно травматичны для рыб, например биопсия. Применение этого метода и последующий расчет индекса поляризации ооцитов возможны при тестировании только зрелых самок. Эндоскопический метод является более современным способом изучения гонад осетровых рыб [9]. Недостатком является то, что определение пола по внешнему виду гонад не даёт достоверного ответа о половой принадлежности особи, особенно на ранних стадиях развития. Достаточно информативным методом для исследования внутренних органов рыб, в том числе прижизненной диагностики степени зрелости половых продуктов, является ультразвуковое тестирование - УЗИ [10]. Описание структуры гонад осетровых в процессе созревания хорошо представлено в научных публикациях, а результаты их поэтапного анализа с помощью УЗИ - в практических руководствах [11, 12]. Для определения степени подготовленности рыб к нересту предлагаются и биохимические тесты. Одни из них характеризуют жировой, белковый, углеводный и окислительный обмен [13-15], другие - активность в крови таких половых гормонов, как тестостерон, 11-кетотестостерон и эстрадиол [16-20]. Гормональный метод почти не травмирует рыб, но достаточно трудоёмок, имеет высокую стоимость и требует определённой квалификации сотрудников рыбоводных предприятий. Индикатором активности окислительного обмена, который реагирует на смену этапов полового цикла, является гемоглобин [21-24]. Исследователи отмечают, что на начальных стадиях созревания гонад уровень гемоглобина в крови невысок. В период трофоплазматического роста его концентрация значительно возрастает, снижаясь на этапе завершения процесса созревания. Низкое содержание гемоглобина в крови у производителей в период активного формирования половых продуктов свидетельствует о нарушении процесса генеративного обмена. Эти рыбы или не реагируют на гормональное воздействие, или их икра не оплодотворяется. Важнейшим биохимическим показателем, характеризующим функциональное состояние рыб, является общий сывороточный белок [25, 26]. Наиболее высокая концентрация белка в крови наблюдается на III-IV СЗГ. По завершении процесса созревания его количество в сыворотке снижается. У осетровых, созревающих под влиянием гипофизарных инъекций, наблюдается умеренное снижение этого показателя в сравнении с естественно нерестующими рыбами. При низком уровне оплодотворения икры или индифферентности по отношению к гипофизарной инъекции концентрация белка в крови у самок осетровых достаточно высокая, что указывает на незавершенность процессов формирования гонад. У истощенных рыб содержание белка в крови патологически низкое [27]. В ходе нерестовой миграции содержание беталипопротеидов у осетровых рыб бывает значительно выше, чем в морской период жизни [28]. У рыб, не отвечающих на гипофизарную инъекцию, отмечается некоторое превышение этого липопротеида над его содержанием в крови нормально созревающих самок. Незрелые особи отличаются от рыб в период нерестовой миграции повышенным уровнем этого показателя. Характерным примером эффективности применения биохимических тестов в диагностике состояния зрелости половых продуктов осетровых рыб явилось изучение их динамики у диких производителей севрюги при их рыбоводном освоении. В 80-90-гг. XX в. наблюдались большие потери икры, низкая выживаемость личинок и молоди, получаемых от производителей севрюги, поступающих на рыбоводные заводы дельты Волги. По мнению ряда авторов, основной причиной этого явилась значительная физиологическая гетерогенность этих рыб. Одновременно выявлялось большое количество рыб с нарушениями генеративного обмена [29-34]. Изучение физиологического статуса самок севрюги до гормональной стимуляции показало, что на осетровые рыбоводные заводы поступали производители с различным функциональным состоянием. Так, у самок севрюги, окончательно завершивших процесс созревания с высокими показателями выклева личинок, в отличие от рыб из группы «недозревшие», закономерно понижался уровень белка, беталипопротеидов и гемоглобина в крови и повышалась скорость оседания эритроцитов (СОЭ). В то же время у производителей, использовавшихся для рыбоводных целей, снижение уровня обменных процессов было менее выражено, чем у рыб, нерестящихся в естественных условиях. Высокое содержание в крови белка и беталипопротеидов - явный признак незавершенности процесса оогенеза. Реакция этой группы рыб на гормональное воздействие была выражена слабо. Пониженный уровень гемоглобина при высоком сывороточном белке сигнализирует о нарушении процесса созревания ооцитов. У рыб с низким рыбоводным эффектом из группы «Перезревшие» интенсивность обменных процессов соответствует определенному этапу подготовки к нересту в естественных условиях, но уже не отвечает требованиям, необходимым для искусственного воспроизводства. Перезревшие рыбы с нулевым уровнем оплодотворения имели высокий уровень белка и патологически низкое содержание беталипопротеидов. Это свидетельствовало о необратимых изменениях физиолого-биохимических характеристик икры. Структурно-метаболическая деградация приводит к потере способности ооцитов оплодотворяться. Концентрация гемоглобина и белково-липидных компонентов крови ниже уровня, отмеченного у производителей севрюги, использованных для рыбоводных целей и давших высокий рыбоводный эффект, свидетельствует об истощении рыб. Низкий уровень накопления жира и белка в организме севрюг в море повлиял на депонирование трофических веществ в икре. По данным П. В. Баденко [35], чаще истощены молодые и тугорослые самки, личинки которых погибают при дальнейшем выращивании. По результатам исследований был сделан вывод о том, что полученные материалы позволяют говорить о возможности применения изученных физиологических тестов для прижизненного отбора физиологически полноценных самок севрюги при использовании на рыбоводных заводах диких производителей. Круглогодичное содержание производителей осетровых и их гибридов в УЗВ при высокой температуре и кормлении высокожирными кормами в определённой степени ещё более усложнило задачу прижизненной диагностики, степени их подготовленности к эффективному нересту обычными методами. Физиологические методы в этом случае представляются более надёжными. Вместе с тем, так же как и рассмотренные ранее методы прижизненной диагностики осетровых рыб, практическое применение биохимических тестов на рыбоводных хозяйствах ограничивается определённой травматичностью методов получения крови, отсутствием технических условий и недостаточной квалификацией сотрудников. В связи с этим продолжается поиск таких методов диагностики, основанных на фундаментальных знаниях физиологии осетровых рыб, которые обеспечили бы не только высокую эффективность тестирования производителей, но и их технологическую адаптивность к условиям рыбоводных хозяйств. Многолетними исследованиями механизмов водно-солевого обмена у осетровых рыб было показано, что естественное созревание гонад вызывает у осетровых рыб глубокие изменения регуляции метаболизма воды и электролитов [35, 36]. При гормональной стимуляции созревания осетровых рыб происходит некоторое снижение осмоляльности сыворотки крови в сравнении с ее значениями у естественно нерестующих рыб. Влияние гормонов на водно-солевой обмен заключается в задержке в организме рыб воды. На V СЗГ в фолликулах под ооцитами появляется значительное количество овариальной жидкости, которая в период полной овуляции обильно скапливается в полости тела. Материалы и методы исследований Исследования биохимического статуса осуществлялись на производителях (самки) русского осетра (Acipenser gueldenstaedtii Brandt, 1833) и белуги (Huso huso Linnaeus, 1758) из естественных популяций Каспийского моря, а также на производителях гибрида стерлядь × белуга (Acipenser ruthensis Linnaeus, 1758 × Huso huso Linnaeus, 1758) на научно-экспедиционной базе «Кагальник» Южного научного центра РАН. Функциональное состояние производителей русского осетра, белуги и стербела оценивали по содержанию в крови гемоглобина, общего сывороточного белка, общих липидов, холестерина, беталипопротеидов и СОЭ. В сыворотке крови и моче, для последующей разработки теста определения зрелости, определяли концентрацию осмотически активных веществ. Кровь брали прижизненным способом из хвостовой вены с использованием шприцов, мочу из мочеточников - с помощью пипетки и резиновой трубки. Осмоляльность сыворотки крови и мочи определяли криоскопическим методом на осмометре OSKR-1. Содержание сывороточного белка определяли на рефрактометре ИРФ-454Б2М. Концентрацию гемоглобина в крови определяли с помощью набора реактивов фирмы PLIVA-Lachema [37, 38]. Общий холестерин определяли с помощью набора реактивов фирмы «Ольвекс диагностикум» [39, 40], общие липиды - с помощью набора реактивов фирмы PLIVA-Lachema [41-43]. Сывороточные беталипопротеиды определяли с помощью набора реактивов фирмы «БИОТЕСТ-Erba-Lachema» [44]. Результаты экспериментов анализировали методами биологической статистики с помощью компьютерных программ. Результаты исследований Исследования биохимического статуса самок осетра, проведенные нами ранее, выявили 3 группы рыб с различным функциональным состоянием. Производители, отнесённые к группе «Истощенные», имели в крови низкий уровень таких биохимических субстратов, как сывороточный белок, альбумины, гемоглобин, общие липиды и холестерин. Одновременно у этих рыб отмечался повышенный уровень СОЭ (рис. 1). а б Осмоляльность икры, ммоль/кг Н2О Осмоляльность сыворотки крови, ммоль/кг Н2О Осмоляльность овариальной жидкости, ммоль/кг Н2О в г Рис. 1. Физиологические показатели самок русского осетра с различным функциональным состоянием У рыб, отнесённых к функциональной норме и к группе недозревших рыб, выявлен более высокий уровень сывороточного белка, гемоглобина, липидов и холестерина, чем у истощенных рыб. У недозревших рыб, по сравнению с нормально созревшими, преобладали общие липиды и холестерин, поскольку в период созревания идёт активный транспорт кровью липидов и белков. У истощённых рыб осмоляльность сыворотки крови оказалась достоверно ниже в сравнении с её значениями у недозревших и нормальных рыб. Это подтверждается и тем, что у этой группы рыб был достоверно ниже уровень сывороточного белка и одновременно повышенный уровень СОЭ. С точки зрения диагностики функционального состояния рыб интересен вывод о том, что у истощённых самок осетра осмоляльность полостной жидкости, как и сыворотки, оказалась достоверно ниже, чем у недозревших рыб. Этим подтверждаются данные некоторых авторов, согласно которым, при естественном созревании гонад и при гормональной стимуляции созревания осетровых рыб, выращенных в искусственных условиях, происходят глубокие изменения регуляции метаболизма воды и электролитов. Аналогичные тенденции динамики биохимических показателей у самок осетра выявлены и у самок белуги (рис. 2). а б СОЭ, мм/ч Осмоляльность овариальной жидкости, моль/кг Н2О в г Осмоляльность овариальной жидкости, моль/кг Н2О Рис. 2. Физиологические показатели самок белуги с различным функциональным состоянием Большую часть исследованных рыб составляли впервые нерестующие самки. Рыбы были представлены двумя функциональными группами: истощённые с низким уровнем сывороточного белка, альбуминов, гемоглобина, липидов и холестерина в крови и близкие к норме. По многим показателям различия между этими группами были статистически достоверными. У истощённых самок белуги, как и у осетра, осмоляльность овариальной жидкости оказалась достоверно ниже, чем у групп рыб близких к норме. Использование осмоляльности (солёности) овариальной жидкости для диагностики степени зрелости половых продуктов у самок осетровых рыб могло бы иметь для рыбоводной практики инновационное значение. Однако появление обильной жидкости в полости тела только после гормональной инъекции делает этот процесс менее доступным, чем, например, получение мочи. Задержка воды в организме осетровых рыб на завершающих этапах созревания половых продуктов должна была неизбежно привести к повышению осмоляльности (солёности) мочи. Исключительная доступность получения мочи у осетровых рыб практически на всех этапах жизненного цикла и нетравматичность этого метода дали основания начать разработку более эффективного и недорого теста для диагностики степени зрелости гонад у этих рыб, выращенных в УЗВ, и прежде всего их гибридов. Помимо изучения многолетней динамики генеративной функции, у производителей стербела на НЭБ «Кагальник» ЮНЦ РАН в период очередного количественного учёта и диагностики состояния их зрелости с помощью УЗИ, производился отбор проб крови и мочи для определения величины биохимических показателей на разных стадиях зрелости гонад. Функциональное состояние производителей и молоди стербела оценивали: по содержанию в крови гемоглобина, общего сывороточного белка, общих липидов, холестерина, беталипопротеидов и СОЭ. В сыворотке крови и моче, для последующей разработки теста по определению зрелости, устанавливали концентрацию осмотически активных веществ. Данные, анализируемые в процессе экспериментальной работы, позволили выявить различия практически по всем исследуемым биохимическим показателям у рыб с различной степенью зрелости половых продуктов (рис. 3). Неспецифический физиологический показатель - СОЭ - проявил закономерную тенденцию к увеличению в процессе созревания рыб. Известно, что у разновозрастных осетровых, ранее исследованных в море, активность гемоглобина была значительно ниже, чем у рыб, мигрирующих на нерест в р. Волгу. У производителей гибрида стерлядь × белуга в УЗВ, находящихся на начальных этапах созревания и завершивших этот этап, концентрация гемоглобина соответствовала его уровню у рыб в море. Вероятно, рыбам, содержащимся в УЗВ и не совершающим нерестовые миграции, нет необходимости вырабатывать дополнительную энергию, и это есть специфика их энергетического обмена. Динамика других биохимических субстратов, которые участвуют в формировании половых продуктов, аналогична той, которая наблюдается у рыб, созревающих в естественной среде. Например, количество сывороточного белка в период формирования половых продуктов достоверно увеличивалось от II до IV СЗГ. Уровень холестерина в крови также имел положительную динамику, увеличиваясь у созревающих рыб. Однако его концентрация в крови заметно превышала её величину у естественно нерестующих рыб, что связано, вероятно, со спецификой питания рыб, выращиваемых в УЗВ. В процессе созревания гонад идёт закономерное увеличение количества беталипопротеидов, транспортируемых кровью. Вместе с тем, несмотря на IV СЗГ, по многим показателям половозрелые самки были ещё относительно далеки от этапа окончательного созревания. У рыб, готовых к гормональной стимуляции, должен был снизиться уровень общего белка, беталипопротеидов и холестерина. Уровень липидов в крови у всех групп рыб, выращенных в УЗВ, был значительно выше, чем у рыб, выловленных в естественной среде. Вероятно, его динамика определяется в первую очередь качественной структурой пищевых компонентов и температурными условиями содержания. Содержание липидов в крови у рыб, выращенных в УЗВ, не проявило себя как диагностический тест на созревание. Холестерин, ммоль/л β-липопротеиды Общие липиды, г/л Общий белок, г/л а б Гемоглобин, г/л в г Рис. 3. Физиолого-биохимические показатели самок стербела различной степени зрелости половых продуктов Наиболее показательным и технологически доступным для диагностики этапов формирования половых продуктов оказался уровень осмоляльности (солёности) мочи. У половозрелых самок на II стадии гонад концентрация осмотически активных веществ в моче была почти в 2 раза выше, чем у неполовозрелых (молодых) рыб. Созревшие рыбы отличались по осмоляльности мочи от молодых и незрелых взрослых рыб соответственно в 3 и 1,4 раза. Различия оказались статистически достоверными. Таким образом, осмоляльность крови оказалась достаточно консервативным физиологическим показателем и не может применяться как диагностический тест (рис. 4). Осмоляльность сыворотки крови, моль/кг Н2О Осмоляльность мочи, моль/кг Н2О Соленость сыворотки крови, г/л Соленость мочи, г/л Рис. 4. Динамика осмоляльности (солености) сыворотки крови и мочи самок стербела различной степени зрелости половых продуктов Таким образом, осмоляльность крови оказалась достаточно консервативным физиологическим показателем и не может применяться как диагностический тест. Заключение В период предварительных исследований на диких производителях осетра и белуги было подтверждено мнение о том, что водно-солевой обмен тесно связан с процессом созревания рыб и показатели, характеризующие его, могут быть использованы для разработки более технологичных методов прижизненной диагностики степени подготовленности производителей рыб к нересту в искусственных условиях. Исследования гибрида стерлядь × белуга выявили, что наиболее показательным и технологичным может быть тест на осмоляльность мочи. Благодаря относительной простоте и нетравматичности метода получения мочи, потенциальным возможностям его технологического совершенствования в направлении определения солёности, этот метод может стать востребованным среди рыбоводов как для отбора производителей при формировании маточных стад, так и для функциональной диагностики производителей на конечных этапах созревания.