ВведениеСистематическое изучение микробного сообщества кишечника рыбы, выращиваемой в условиях аквакультуры, позволит скорректировать пути поддержания его в стабильном состоянии, что способствует повышению количества необходимых ферментов в пищеварительной системе рыбы при включении отдельных компонентов питания в ее рацион [1]. Поэтому для будущих исследований весьма важно, чтобы применяемые методы идентификации микроорганизмов помогали распознавать уникальные характеристики рыб и избегать применения протоколов, разработанных для наземных гомойотермных животных. В настоящее время наряду с традиционными методами стало возможным использование автоматизированных систем идентификации микроорганизмов, которые не требуют значительных временных и финансовых затрат. Широкое распространение получила методика определения степени соответствия уникального для каждого вида микроорганизма набора рибосомальных белков («протеомная дактилоскопия») с помощью десорбционного метода «мягкой» ионизации, обусловленной воздействием импульсами лазерного излучения на матрицу с анализируемым веществом на основе технологии матрично-активированной лазерной десорбции/ионизации времяпролетной масс-спектрометрии (Matrix Assisted Laser Desorption / Ionization Time of Flight – MALDI-TOF MS) [2]. Несмотря на то, что MALDI-TOF MS – это «фенотипическая» система, она, в некотором смысле, заполняет пробел в достоверности результатов испытаний, полученных с помощью биохимических систем фенотипирования, а также идентификационных систем генотипирования [3].Использование различных современных подходов к идентификации микроорганизмов, сочетающих стандартные микробиологические методы и современные автоматизированные «фенотипические» системы, позволит получить в дальнейшем достоверную картину взаимодействия макроорганизма с микробными сообществами и отнести их к определенному классу бонитета.  Цель исследования – проведение сравнительного анализа эффективности идентификации микроорганизмов при исследовании микробиома кишечника садковой радужной форели (Oncorhynchus mykiss) с помощью комплексного подхода, сочетающего использование классического (традиционного) биохимического метода и современного экспресс-метода – времяпролетной масс-спектрометрии (MALDI-TOF MS). Материал и методы исследованийИсследования проводились на базе кафедры микробиологии и биохимии Мурманского государственного технического университета (с мая 2023 г. – Мурманский арктический университет) в рамках реализации инициативных научно-исследовательских работ «Комплексные исследования объектов аквакультуры в условиях Кольского Заполярья» № ГР АААА-А19-119030590051-4 (период реализации 01.2019–01.2023 гг.). Объектом исследования послужила пресноводная садковая радужная форель (Oncorhynchus mykiss) генераций 2018–2023 гг. Отбор проб рыбы проводили в период с сентября 2020 по март 2023 г. на форелевой садковой ферме, расположенной в районе п. г. т. Верхнетуломский. Все манипуляции с рыбой осуществляли с соблюдением международных биоэтических норм и требований при работе с животными [4]. Клинический осмотр и патологоанатомическое вскрытие рыбы проводили по стандартной методике [5], принятой в ихтиопатологии.  Культуры микроорганизмов выделяли из образцов кишечной слизи и содержимого кишечника умерщвленной рыбы в соответствии с рекомендациями [6]. В зависимости от возраста рыбы объем кишечной слизи и содержимого рассчитывали по методике, разработанной коллективом авторов [7] (И. В. Ускова, В. А. Потешкина, К. А. Калинчук).Кишечник от среднего до дистального отдела асептически отделяли от брюшной полости стерильными ножницами и перемещали в стерильную чашку Петри. Вырезанный сегмент кишечника осторожно очищали от брыжеечного жира и вскрывали продольно. Слизистую и содержимое кишечника анализировали отдельно. Сначала извлекали содержимое кишечника в отдельную чашку Петри, а затем, после отмывки в 0,9 %-м физиологическом растворе, соскребали слизь стерильным скальпелем. Полученные образцы слизи и содержимого кишечника перемещали в стерильные пробирки с 0,9 %-м физиологическим раствором в объеме 1/10. Из исходного разведения готовили ряд последовательных десятикратных разведений и высевали в жидкие накопительные среды (первичный посев) – Бликфельдта (НПЦ «Биокомпас-С», Россия) и ГМФ-бульон (НИЦФ, Россия) в двух-трехкратных повторностях.  Посевы инкубировали в аэробных условиях при температуре 18 ± 3 °С в течение 7–14 дней [8].  Просмотр посевов проводили ежедневно, отмечая интенсивность и характер роста микроорганизмов в жидких средах: в ГМФ-бульоне наблюдали диффузное помутнение среды, образование пристеночного кольца, пленки, осадка; в среде Бликфельдта – изменение цвета среды с фиолетового на желтый. Для получения изолированных колоний стерильной петлей делали пересевы культур из каждого посева с видимыми признаками роста на поверхность чашки Петри с плотной питательной средой: Бликфельдта (НПЦ «Биокомпас-С», Россия), ГМФ-агара (НИЦФ, Россия). После 7 дней инкубирования отмечали размер, рельеф, контур края, поверхность, цвет, консистенцию колоний [9].Чистоту выделенных чистых культур микроорганизмов проверяли визуально (рост микроорганизмов по штриху на поверхности скошенного агара), микроскопически (окраска по Граму и микроскопия с иммерсионной системой). Следует иметь в виду, что заключение о чистоте некоторых культур микроорганизмов нельзя сделать только по результатам высева на вышеуказанные питательные среды. Особенно это касается представителей гетеротрофов, склонных развиваться с одним или несколькими спутниками [10]. Таким образом, дополнительно чистоту культур микроорганизмов проверяли высевом на ряд сред производства ФБУН ГНЦ ПМБ (Оболенск, Россия): агар-ЭНДО-ГРМ для выделения энтеробактерий, SS-агар для выделения сальмонелл и шигелл, XLD-агар для выделения и идентификации патогенных энтеробактерий, дифференциально-элективная среда для выделения клебсиелл, среда № 10 для идентификации Staphylococcus aureus. Полученные изоляты идентифицировали с применением традиционного метода, основанного на исследовании морфолого-тинкториальных, культуральных и биохимических свойств с использованием определителя Берджи [11, 12] и современного лабораторного экспресс-метода – MALDI-TОF MS. Морфологические и тинкториальные особенности изучали с применением светового микроскопа Olympus CX23LEDRFS1 (Япония) с общим увеличением ×1 000. Фотосъемку препаратов проводили с помощью цифровой камеры ADF и программного обеспечения ADF Image Capture. Фиксированные и живые препараты готовили стандартными методами [13]. Для окраски по Граму использовали коммерческий комплект реагентов Микро-ГРАМ-НИЦФ (Россия). Биохимические свойства (сахаролитическая и протеолитическая активность) определяли как по стандартным методикам с использованием дифференциально-диагностических сред Гисса (индикатор бромкрезоловый пурпурный, мальтоза, ксилоза, рамноза, дульцит) фирмы Биокомпас-С (Россия), питательной желатины [14], так и коммерческих наборов для межродовой/видовой дифференцировки бактерий (системы индикаторных бумажек (СИБ) фирмы Микроген (Россия) – набор № 1 и 2, Микро-КАТАЛАЗА-НИЦФ (Россия) согласно рекомендации производителя). Масс-спектрометрический анализ проводили на масс-спектрометре microfler MALDI-TOF MS с использованием программного обеспечения Biotyper 3.0 (Bruker Daltonics, Германия) в линейном режиме. Реактивы, используемые для идентификации с помощью MALDI-TOF MS: бактериальный калибровочный стандарт Брукер (BTS), порционная альфа-циановая матрица Брукер (Bruker HCCAportioned Matrix), стандартный раствор (OS, 50 % ацетонитрил, 2,5 % трифторуксусная кислота, 47,5 % вода), ультрачистая вода (ASTM Type I), этанол абсолют ≥99,8 % (неденатурированный), муравьиная кислота (чистота ~ 98 %), ацетонитрил ≥99,9 для ВЭЖХ/МС (LC-MS grade). Калибровку  масс-спектрометра  проводили  перед исследованием каждой серии идентификаций согласно руководству пользователя масс-спектрометра microfler MALDI-TOF MS Biotyper 3.0, используя в качестве калибранта бактериальный калибровочный стандарт Брукер (BTS). Для идентификации микроорганизмов использовали метод прямого нанесения материала единичной колонии микроорганизма на лунку металлического планшета масс-спектрометра стерильной одноразовой петлей. На лунку с нанесенным материалом капали матрицу и подсушивали. Затем мишень загружали в прибор для получения спектров. Для каждого исследуемого образца в методе MALDI-TOF MS использовали не менее 4-х повторений. С целью анализа полученных масс-спектров применяли программное обеспечение flexControl – для измерений, flexAnalysis – для контроля качества, Biotyper OC – для создания новых записейв базе данных (MSP).В процессе масс-спектрометрии определяются два параметра: отношение ионов к их заряду – m/z и количество частиц с конкретной величиной m/z. Зависимость этих двух величин называют масс-спектром (непрерывная зависимость на определенном интервале). В MALDI-TOF MS для видовой идентификации микроорганизмов используют иную характеристику – масс-спектр-профиль (МСП). В программном аппарате Bruker Daltonics для отображения силы сходства МСП неизвестного микроорганизма с типовым коллекционным штаммом используется переменная «score value». Также разработчики из Bruker Daltonics предложили категории (А, В, С), которые характеризуют не только совпадение с наиболее схожим МСП, но и отражают совокупность из 10 МСП, наиболее близких к исследуемому [15].В соответствии с требованиями производителя при значениях коэффициента достоверности Score Value (SV) 1,6 и ниже идентификацию считали ненадежной. Для интерпретации полученных результатов применяли стандартные диапазоны значений коэффициента достоверности SV (табл. 1)и категории идентификации (табл. 2) [16]. Таблица 1Table 1 Значение Score ValueThe Score ValueДиапазон коэффициента достоверности SVОписаниеСимволЦвет категории идентификации2,30–3,00Достоверная видовая идентификация микроорганизмов(+++)Зеленый2,00–2,29Достоверная родовая идентификация микроорганизмов.Высокая вероятность видовой идентификации(++)1,70–1,99Высокая вероятность родовой идентификации микроорганизмов(+)Желтый0,00–1,69Нет точного результата идентификации(ненадежная идентификация)(–)КрасныйТаблица 2Table 2 Категории идентификации (A – C)Identification categories (A – C)КатегорияидентификацииОписаниеAВсе 10 наиболее вероятных кандидатов принадлежат к одному роду.Зеленая категория – точное видовое соответствие, желтая категория – точное родовоесоответствиеBПредложенные 10 наиболее вероятных кандидатов принадлежат к разным родам.Зеленая и желтая категории – видовое и родовое соответствиеCНет ни видового, ни родового соответствия. Проверьте родственные микроорганизмыили анализируемый образец на предмет загрязнения  Полученные результаты сравнивали с базой данных на NCBI (National Center for Biotechnology Information). Результаты и обсуждениеВ результате исследования микробиома кишечника садковой радужной форели было выделено 11 различных микробных изолятов: 7 (№ 2, 5–8, 10, 11) – из содержимого, 4 (№ 1, 3, 4, 9) – из слизистой кишечника. Необходимо отметить, что наибольшее количество микробных изолятов выделено из содержимого кишечника рыб, что соответствует литературным данным. Так, в результате подсчета доминирующих форм микроорганизмов в кишечнике радужной форели (Oncorhуnchus mykiss) было выявлено, что на слизистой кишечника бактерий на 2–3 порядка ниже, чем в его содержимом [17]. Как правило, под воздействием различных стрессовых факторов нарушается уже сложившийся естественный баланс микробиома кишечника и, как следствие, бактерии намного слабее закрепляются на слизистой кишечника и легко удаляются вместе со слизью, что сопровождается значительным увеличением их количества в химусе [18].  В исследованиях P. M. Fidopiastis [19] на 15 различных питательных средах количество культивируемых форм микроорганизмов от общего числа бактерий, изолированных из кишечника морских растительноядных рыб, не превышало 5 %. По расчетам T. Ринго с соавторами [20], культивируется только 3 % микроорганизмов, выделенных из заднего отдела кишечника рыбы, что подтверждает результаты наших исследований. На этапе лабораторного эксперимента полученные изоляты идентифицировали с применением традиционного метода, основанного на исследовании морфолого-тинкториальных, культуральных и биохимических свойств с использованием определителя Берджи и современного лабораторного экспресс-метода – MALDI-TОF MS. Проведенные исследования позволили установить различия в идентификации бактерий по классическому биохимическому методу и MALDI-TOF MS. При исследовании культуральных свойств микробных изолятов в жидких питательных средах рост в накопительной среде ГМФ-бульон визуально обнаруживали в виде диффузного помутнения и образования поверхностных пленок. На жидкой среде Бликфельдта отмечали равномерное помутнение и изменение цвета с фиолетового на желтый за счет кислотно-основного индикатора (бромкрезолового пурпурного), входящего в ее состав. На неселективной плотной питательной среде ГМФ-агаре установили следующие культуральные свойства изолятов: № 1 формировал округлые, пастообразные, ярко-желтые или золотистые колонии; № 2 – гладкие, не пигментированные колонии; № 3 – морщинистые с неровными краями, сероватые; № 4 – ровные, пастообразные, слегка желтоватые колонии; № 5 – плоские, слизистые, гладкие; № 6 – округлые, гладкие, слизистые; № 7 – округлые, выпуклые, с ровными краями, светло-бежевого цвета; № 8 – округлые, гладкие, серо-белые, блестящие, с ровными краями; № 10 – округлые, гладкие, слизистые, со слегка сероватым налетом; № 11 – округлые, с глянцевой поверхностью колоний, слегка сероватого цвета. На плотной среде Бликфельдта изолят № 9 формировал округлые, гладкие, выпуклые светло-бежевые колонии, с ровным краем, однородной консистенцией. Вокруг колоний отмечали диффузное изменение цвета среды с фиолетового на желтый. На агаре-ЭНДО-ГРМ изоляты № 5, 6, 10 – небольшие бледно-розовые колонии, № 8 – средние колонии (диаметром до 3 мм) малинового цвета с ярким металлическим блеском. На XLD-агаре изолят № 8 формировал средние (диаметр до 3 мм) круглые желтые колонии с зоной вокруг. На дифференциально-элективной среде для выделения клебсиелл изолят № 7 формировал средние (диаметр до 4 мм) круглые слизистые колонии малинового цвета. На SS-агаре и среде № 10 видимых признаков роста не зафиксировано в течение всего периода инкубирования. При исследовании морфологических и тинкториальных свойств выявили 5 грамположительных (№ 1–4, 9) и 6 грамотрицательных изолятов (№ 5–8, 10, 11). В морфологическом отношении преобладали палочковидные формы (№ 2–11). Микробные изоляты № 2–4 – спорообразующие.Все исследованные изоляты протестировали  на способность использовать различные субстраты с помощью коммерческих систем (СИБ № 1 и 2) фирмы «Микроген» (Россия), микро-КАТАЛАЗА-НИЦФ (Россия). Биохимические свойства выделенных чистых культур микроорганизмов представлены в табл. 3. Таблица 3Table 3 Биохимическая характеристика выделенных чистых культур микроорганизмов Biochemical characteristics of isolated pure cultures of microorganismsПоказательМикробные изоляты кишечника рыбы№ 1№ 2№ 3№ 4№ 5№ 6№ 7№ 8№ 9№ 10№ 11Каталаза++++++++–++Оксидаза+–––++–––++b-галактозидаза––––––++–––Декарбоксилаза лизина––––––++–––Декарбоксилаза орнитина+––––––+–––Глюкоза–++–++++++–Сахароза––+–+++++++Лактоза––––––+++––Мальтоза++++––+++––Манноза––––+++++––Ксилоза–––––+++–––Рамноза+––––++++––Маннит–+++–++++–+Дульцит+–––––+++––Сорбит+–––––++–––Желатин++++–––––––Индол––––––++–––Сероводород–––––––––––Утилизация цитрата+–––––+––––Утилизация малоната+–––––+––––Реакция Фогеса – Проскауэра––––––+–+––  Большинство изолятов (№ 1–8, 10, 11) обладали каталазной активностью, изоляты № 1, 5, 6, 10, 11 обладали оксидазной активностью, а изоляты № 7, 8 – b-галактозидазной активностью. Способны декарбоксилировать диаминокислоты: лизин – изоляты № 7, 8, орнитин – изоляты № 1, 8. Определена способность изолятов № 7 и 8 ферментировать весь предлагаемый в лабораторных условиях спектр углеводов (глюкоза, лактоза, сахароза, мальтоза, манноза, ксилоза, рамноза) и многоатомных спиртов (маннит, дульцит, сорбит), а также образовывать индол. Изолят № 9 не ферментировал ксилозу и сорбит, № 6 не ферментирует лактозу, мальтозу, дульцит, сорбит. Остальные штаммы могли ферментировать от двух до четырех наименований углеводов и многоатомных спиртов. Утилизировать цитрат и малонат оказались способны изоляты № 1 и 7, продуцировать ацетоин (ацетилкарбинол) могли изоляты № 7 и 9. При исследовании протеолитической активности было выявлено, что изоляты № 1–4 оказались способны гидролизовать желатин в течение двух-трех недель.Выявлено только две культуры бактерий, образующих фермент триптофаназу – изоляты № 7 и 8. Все изолированные микроорганизмы не способны восстанавливать сульфат до сероводорода (H2S) для получения энергии. Таким образом, в результате идентификации микроорганизмов классическим биохимическим методом было определено, что большая часть относилась к родам Bacillus (№ 2, 3, 4) и Pseudomonas (№ 5, 6, 10, 11), а остальные к родам Micrococcus (№ 1), Klebsiella (№ 7), Lactobacillus (№ 9). Изолят № 8 идентифицировали до вида – Escherichia coli.В процессе проведения масс-спектрометрического анализа полученных изолятов были получены результаты идентификации микроорганизмов по белковому профилю (табл. 4).  Таблица 4Table 4 Идентификация микробных изолятов методом MALDI-TOF MSIdentification of microbial isolates by MALDI-TOF MS№ изолятаЗначение SVКатегорияидентификацииСимволЦвет категории идентификацииРезультаты идентификациидо рода/вида12,1 ± 0,1А(++)ЗеленыйMicrococcus luteus22,0 ± 0,04А(++)Bacillus pumilus31,8 ± 0,09В(+)ЖелтыйBacillus spp.42,0 ± 0,05А(++)ЗеленыйBacillus pumilus51,8 ± 0,05В(+)ЖелтыйPseudomonas spp.61,8 ± 0,04В(+)Pseudomonas spp.72,1 ± 0,05A(++)ЗеленыйKlebsiella oxytoca82,2 ± 0,13A(++)Escherichia coli92,1 ± 0,04А(++)Carnobacterium maltaromaticum101,8 ± 0,05B(+)ЖелтыйPseudomonas spp.111,9 ± 0,05B(+)Achromobacter spp.  Значение коэффициента достоверности SV варьировало в достаточно широком диапазоне – от 1,8 до 2,2. Из 44 снятых МСП не получено ни одного значения показателя SV, входящего в диапазон от 2,3 до 3,0 (см. табл. 4). Только для 6 (55 %) микробных изолятов (№ 1 – Micrococcus luteus, 2 – Bacillus pumilus, 4 – Bacillus pumilus, 7 – Klebsiella oxytoca, 8 – Escherichia coli, 9 – Carnobacterium maltaromaticum) удалось получить МСП, находящиеся в диапазоне значений коэффициента достоверности SV от 2,0 до 2,3 (см. табл. 4), что позволяло уверенно отнести их к категории А (точное родовое и видовое соответствие). Для 5 (45 %) микробных изолятов (№ 3 – Bacillus spp., 5 – Pseudomonas spp., 6 – Pseudomonas spp., 10 – Pseudomonas spp., 11 – Achromobacter spp.) удалось провести вероятную родовую идентификацию и отнести их к категории В.Только для изолята № 8 удалось провести идентификацию до вида, что соответствовало результатам масс-спектрометрического анализа.Сравнительные результаты идентификации микроорганизмов различными методами идентификации представлены в табл. 5. Таблица 5Table 5 Результаты идентификации микроорганизмов по классическому биохимическому методуи масс-спектрометрии MALDI-TOF MS (белковому профилю)Results of identification of microorganisms by the classical biochemical methodand MALDI-TOF MS (protein profile) mass spectrometry№ изолятаБиохимический методMALDI-TOF MS1Micrococcus spp.Micrococcus luteus2, 4Bacillus spp.Bacillus pumilus3Bacillus spp.Bacillus spp.5, 6Pseudomonas spp.Pseudomonas spp.7Klebsiella spp.Klebsiella oxytoca8Escherichia coliEscherichia coli9Lactobacillus spp.Carnobacterium maltaromaticum10Pseudomonas spp.Pseudomonas spp.11Pseudomonas spp.Achromobacter spp.  Из 11 микробных изолятов, идентифицированных как с помощью биохимического метода, так и с помощью метода MALDI-TOF MS, только 8 (№ 1–7, 10) совпадали на уровне рода. У микробных изолятов № 9 и 11 провести при помощи стандартных биохимических подходов идентификацию до рода не удалось – белковый профиль идентификации соответствовал Carnobacterium spp. и Achromobacter spp. Поэтому с целью улучшения классических методов биохимической идентификации необходимо применять современные экспресс-методы [21, 22], такие как MALDI-TOF MS, который выполняет поиск по существующим базам белковых профилей микроорганизмов, что сопоставимо с идентификацией по 16sРНК [23]. ЗаключениеВ результате исследований микробиоты кишечника садковой радужной форели выделены и идентифицированы 11 микробных изолятов с применением комплексного подхода для достижения максимально высокой чувствительности полученных результатов. Проведенное исследование подтвердило высокие возможности MALDI-TОF MS анализа для быстрой и точной идентификации микроорганизмов до видового уровня. Для 5 изолятов удалось провести с высокой вероятностью родовую идентификацию, доминирующей группой оказались псевдомонады и бациллы. Достоверную родовую и высокую видовую идентификацию удалось провести для 6 изолятов (см. табл. 5), из них два изолята (№ 2, 4) оказались одного вида (Micrococcus luteus, Bacillus pumilus, Escherichia coli, Carnobacterium maltaromaticum, Klebsiella oxytoca). В микробиоценозе слизистой рыб из группы молочнокислых микроорганизмов были обнаружены бактерии рода Сarnobacterium, а именно вид Carnobacterium maltaromaticum.