Введение Аквакультура является одной из важных и перспективных отраслей мирового рыбного хо-зяйства, которая способствует увеличению и сохранению биологических ресурсов. Мировое производство аквакультуры в 2014 г. достигло 73,8 млн т, что эквивалентно 160,2 млрд долл. США в точке первой продажи, из них 16,1 млн т составляют моллюски (на 19 млрд долл. США) [1]. Согласно данным ФАО (продовольственной и сельскохозяйственной организации ООН) в 2016 г. производство в морской и прибрежной аквакультуре практически приблизилось к 30 млн т (67,4 млрд долл. США), из них на двустворчатые моллюски приходится 16,9 млн т (58,8 % общего объема производства). При этом, по расчетам специалистов, общее производство рыболовства и аквакультуры к 2030 г. может вырасти до 201 млн т [2]. В последнее время многие марикультурные хозяйства, использующие методы садкового культивирования, начали сталкиваться с массовой гибелью выращиваемых гидробионтов [3], что сопровождается большими финансовыми потерями. Массовая смертность отмечена у разных видов культивируемых двустворчатых моллюсков: устриц, гребешков и мидий. Зачастую она связана с воздействием паразитов, риккетсиоподобных организмов [4, 5], вирусов, бактерий [6, 7] и пр. Также существуют иные предпосылки, влияющие на выживаемость гидробионтов, такие как факторы окружающей среды, чрезмерная плотность посадки, инбридинг [4]. Для дальнейшего устойчивого развития хозяйств марикультуры требуется тщательное изучение последствий промышленного культивирования гидробионтов для окружающей среды, а также постоянная оценка физиологического состояния культивируемых гидробионтов, позволяющая на ранних стадиях оперативно выявлять патологические изменения, которые, в свою очередь, могут привести к массовой гибели культивируемых объектов [7, 8]. Прибрежная полоса Приморского края является одним из наиболее перспективных регио-нов России для развития марикультуры благодаря хорошим климатическим условиям и наличию значительных по площади акваторий, особенно в южной части края, пригодных для культивиро-вания гидробионтов. На сегодняшний день здесь насчитывается более 50 действующих марикультурных хозяйств, которые занимаются разведением наиболее ценных видов моллюсков, иглокожих и водорослей [9]. На протяжении последних десятилетий гребешок приморский Mizuhopecten yessoensis является одним из традиционных культивируемых морских двустворчатых моллюсков в Приморском крае. Однако в последние годы некоторые хозяйства сталкиваются с массовой гибелью моллюсков в процессе выращивания. Цель данной работы – изучение эффективности использования биомаркеров в качестве прогностических сигналов для выявления причин гибели M. yessoensis разных поколений. Материал и методика исследования Исследование проводили на гребешках разных поколений с интервалом 10 лет, культиви-руемых садковым способом в марикультурном хозяйстве, расположенном в бухте Северной (Славянский залив) (рис. 1). Рис. 1. Карта-схема района работ В работе сравнивали два поколения M. yessoensis: первое – нерест 2005 г., второе – нерест 2015 г. Моллюсков отбирали в посленерестовый период (октябрь), в возрасте 1+, 2+ и 3+ для нереста 2005 г. и 1+, 2+ для нереста 2015 г., т. к. после летнего периода была зарегистрирована массовая смертность моллюсков возраста 3+. Для исследования моллюски были изъяты из садков, препарированы на льду, из них вы-делены жабры и пищеварительная железа. Определение уровня повреждения молекулы ДНК при использовании кометного анализа проводилось сразу после извлечения тканей из моллюсков в помещениях научно-производственного департамента Дальрыбвтуза, расположенного в бухте Северная. Остатки тканей, предназначающихся для определения малонового диальдеги-да (МДА), немедленно замораживали в жидком азоте (сосуд Дьюара СДС-6М) и транспортиро-вали в лабораторию для дальнейшей обработки. Определение количества повреждений молекулы ДНК. При определении количества повреждений в молекуле ДНК использовали щелочной вариант кометного анализа [10], успешно адаптированного к морским организмам. Данный подход является перспективным современным диагностическим и прогностическим инструментом для выявления скрытых патологических сдвигов в любых организмах [11]. Визуализацию и регистрацию ДНК-комет осуществляли с помощью сканирующего флуо-ресцентного микроскопа (Zeiss, AxioImager A1), оснащенного цифровой фотокамерой AxioCam MRc. Для обработки цифровых изображений была использована компьютерная программа CometScore Freeware v1.5, которая позволяет вычислять различные параметры комет, указыва-ющие на степень повреждения клеточной ДНК. Для каждой кометы рассчитывали долю ДНК в хвосте кометы (DNAt). В исследованных группах гребешков анализировали по 15 гель-слайдов (1 слайд = 1 особь), содержащих не менее 50 комет в каждом. Определение содержания МДА. Содержание МДА – продукта окислительной деградации жирных кислот – определяли в тканях и субклеточных фракциях по цветной реакции с 2-тиобарбитуровой кислотой [12]. Измерения проводили на спектрофотометре Shimadzu UV-1650 PC. Относительное содержание МДА выражали в нмолях в расчете на грамм сырого веса. Исследование проводили в 15 параллельных пробах, где 1 проба = 1 особь. Статистическая обработка полученных результатов проводилась с использованием пакета прикладных программ STATISTICA 6.0 и Microsoft Excel 2016. Оценку проводили по каждому эксперименту путем сравнения среднегрупповых показателей (Р < 0,01 с использованием критерия Манна – Уитни). Коэффициенты корреляции были оценены с использованием регрессии Пирсона. Результаты и обсуждение В результате исследования установлено, что у годовалых (1+) и двухгодовалых (2+) гре-бешков поколения 2015 г. степень деградации молекулы ДНК в жабрах и пищеварительной же-лезе оказалась значительно выше, чем у гребешков поколения 2005 г. (рис. 2). Рис. 2. Степень повреждения молекулы ДНК жабр и пищеварительной железы M. yessoensis поколений 2005 и 2015г.: «*» – достоверные отличия между поколениями P = 99 % (критерий Манна – Уитни); а, b –достоверные отличия между разными возрастами одного поколения, р < 0,01 (регрессия Пирсона) Очевидно, что уровень повреждения молекулы ДНК у моллюсков поколения 2005 г. – как в жабрах, так и в пищеварительной железе – у всех исследованных возрастных групп находился практически на одном уровне и не превышал 20 %. При этом достоверных различий между раз-новозрастными группами нереста 2005 г. выявлено не было. У M. yessoensis поколения 2015 г. уровни повреждения ДНК жабр и пищеварительной же-лезы также достоверно не отличались у разновозрастных особей. Достоверные отличия отмече-ны у годовалых и двухгодовалых особей поколений 2005 и 2015 г., так, в жабрах и пищевари-тельной железе гребешков поколения 2015 г. уровень повреждения молекулы ДНК был выше в в среднем в 2,5 раза, в отличие от моллюсков поколения 2005 г. Содержание МДА в тканях гребешков (рис. 3) имеет сходную картину с уровнем повре-ждения ДНК. Рис. 3. Уровень МДА в жабрах и пищеварительной железе M. yessoensis поколений 2005 и 2015 гг.: «*» – достоверные отличия между поколениями P = 99 % (критерий Манна – Уитни); а, b – достоверные отличия между разными возрастами одного поколения, р < 0,01 (регрессия Пирсона) У M. yessoensis нереста 2015 г. данный показатель значительно выше: практически в 3 ра-за в жабрах и более чем в 5 раз в пищеварительной железе, чем у гребешков поколения 2005 г. (рис. 3). Так, у поколения 2005 г. концентрация МДА в жабрах находилась в пределах 2–2,5 нмоль/г сырого веса, в пищеварительной железе 5–7 нмоль/г. Как видно из полученных результатов, достоверных различий между возрастными группами в пределах одного поколения выявлено не было. При этом достоверно различались между собой одновозрастные группы двух исследованных нами поколений моллюсков. Также была отмечена значительная положительная корреляция между уровнем МДА в тканях и процентом повреждений ДНК в исследованных тканях у двух разных поколений гребешков (P < 0,05). Следует отметить, что в октябре 2017 и 2018 гг. наблюдалась смертность моллюсков по-коления 2015 г.: в возрасте 2+ – более чем 50 %, в возрасте 3+ – 95 %. При этом у поколения 2005 г. массовой гибели не наблюдалось, смертность составляла менее 20 % во всех возрастных группах. Исходя из полученных результатов, можно сделать вывод, что поврежденность моле-кулы ДНК клеток жабр и пищеварительной железы M. yessoensis при значениях более 40 % (см. рис. 2) и высокие уровни МДА (см. рис. 3) в тканях являются сигналами необратимых по-следствий, протекающих в организме, которые приводят к массовой гибели гидробионтов. Из-вестно, что МДА является широко используемым индикатором развития окислительного стрес-са, при этом содержание высоких концентраций МДА в тканях (см. рис. 3) само по себе может приводить к повреждению молекулы ДНК и мутациям [13]. Скорее всего, в периоды массовой гибели моллюски находятся в состоянии оксидативного стресса, что подтверждается значитель-ным увеличением содержанием МДА в тканях моллюсков, при этом повреждение молекулы ДНК достигает критических значений, практически 50 %. Разные исследователи отмечают, что пик смертности в гребешковых хозяйствах соответ-ствует поздней части нереста [4–6]. Считается, что именно стресс, связанный с нерестом, является основным фактором гибели моллюсков из-за ослабления основных защитных систем организма (иммунной, антиоксидантной, репаративной), и именно в этот период организм подвержен различным инфекциям и инвазиям [4]. Еще к одной из предпосылок высокой смертности гидробионтов некоторые авторы относят чрезмерную плотность посадки, которая способствует развитию инфекционных процессов, а также имбридинг, ослабляющий защитный физиологический потенциал культивируемых моллюсков [3–8]. Наши результаты подтверждают данные выводы, т. к. именно несостоятельность системы репарации молекулы ДНК приводит к накоплению по-вреждений в ее структуре, а ослабление антиоксидантной защиты способствует накоплению продуктов перекисного окисления липидов в тканях. Заключение Анализ экспериментальных данных свидетельствовал о том, что моллюски поколения 2015 г. испытывали выраженный окислительный стресс, и это привело к повышению содержа-ния МДА в тканях и значительному повреждению ДНК. Считаем, что данные биомаркеры яв-ляются ранними и чувствительными индикаторами, отражающими физиологическое состояние культивируемых моллюсков, а также сигналами о возникновении развития патологий, ведущих к массовой гибели гидробионтов. Так, при уровне повреждения молекулы ДНК у гребешков возраста 1+ в диапазоне 40–50 % можно предвидеть предстоящие экономические потери в связи с массовой гибелью гидробионтов в следующем году. Конечно, для того чтобы с уверенностью делать такие прогнозы, необходимо собрать больше данных о поврежденности генома и уровнях содержания МДА на разных и более ранних возрастных стадиях моллюсков. Результаты, полученные в данной работе, могут быть использованы для начала нового и перспективного направления по прогнозированию устойчивости не только хозяйств марикультуры, но и есте-ственных экосистем в тех морских акваториях, которые используются для промышленного вос-производства гидробионтов.