В настоящее время низкотемпературное консервирование является одним их наиболее доступных и приемлемых способов долгосрочного хранения клеток [1-5]. При анализе устойчивости и повреждения в результате замораживания живых систем и других биологических объектов большое значение придается характеру кристаллизации в них воды. Благодаря применению различных методов микроскопии, микрокиносъемки и рентгеноструктурного анализа достигнут значительный прогресс в изучении явлений кристаллизации жидкостей в организме и различных растворов - как содержащих, так и не содержащих органические вещества. Очевидно, что в основе успеха криоконсервации лежит разработка такой методики (а впоследствии и технологии), которая сможет обеспечить: - достаточно надежную защиту целостности клеточных органелл после процессов замораживания-оттаивания; - необходимый запас энергетических веществ, обеспечивающих начало обменных процессов в клетках и тканях после двойного температурного шока. Состояние проблемы В процессе криоконсервирования клетки подвергаются воздействию целого комплекса стрессовых факторов, которые вызывают структурные и функциональные изменения различных субклеточных систем. Данные процессы могут развиваться на этапе, предшествующем замораживанию, в зоне положительных температур в присутствии криопротекторов, а также под влиянием охлаждения и(или) отогрева. Это относится и к таким важным приемам, как режимы замораживания и оттаивания образцов спермы, которые в большей степени обеспечивают сохранность клеток [6, 7]. Образование вне- и внутриклеточного льда является основной причиной повреждений клеток при охлаждении [8-13]. Анализируя механизмы криоповреждений на различных уровнях биологической организации, можно прийти к заключению, что в основе отмирания живых структур после воздействия на них глубокого холода лежат необратимые криолитические изменения отдельных компонентов клетки, участвующих в ее структурно-функциональной организации и что наиболее чувствительны к криоповреждениям биомембраны [14]. Возможными причинами криоповреждений клеток могут быть также диспропорции активностей внутриклеточных ферментов, разбалансировка энергетических механизмов и необратимые сдвиги в механизмах транскрипции и трансляции. Однако соотношение этих процессов в клетке при охлаждении, равно как и степень их обратимости после замораживания-отогрева, остаются малоизученными. Физико-химическое состояние мембран во многом определяет течение следующих важных процессов в клетке: биосинтез белка, нуклеиновых кислот и липидов, синтез и расход высокоэнергетических субстратов, транспорт веществ и утилизация различных промежуточных продуктов метаболизма [15]. Существенная роль в обеспечении жизнедеятельности клетки принадлежит митохондриям, которые осуществляют реакции окисления-восстановления, сопряженные с генерацией и аккумуляцией энергии, а также лизосомам, которые регулируют ряд ферментативных процессов [16]. Некоторые исследователи считают, что основной причиной гибели клеток во время их замораживания является именно криоразрушение митохондрий и лизосом [17, 18]. Низкие температуры вызывают существенные физико-химические перестройки липидных компонентов мембраны. В частности, это сопровождается фазовыми переходами липидов, их латеральным разделением в плоскости бислоя и образованием специфических закристаллизованных липидных доменов. Эти процессы нарушают функционирование мембраносвязанных ферментов, что в первую очередь отражается на кинетике каталитических белков, регулирующих активный транспорт ионов и биомолекул. Возникающие при этом нарушения могут изменить ионную асимметрию за счет увеличения (либо уменьшения) мембранной проницаемости [19, 20]. Неорганические компоненты и вода, входящие в состав мембраны, также оказывают существенное влияние на ее функционирование [21]. Результаты исследований структур клеток и их органелл свидетельствуют о том, что влияние глубокой заморозки может затронуть любые из их составляющих, что является немаловажным препятствием для сохранения целостности клеток и тканей при криоконсервации. Неотъемлемый этап технологического процесса низкотемпературного консервирования биологических объектов - фазовый переход «вода - лед» - обусловливает возникновение целой цепочки повреждающих факторов, к которым, прежде всего, следует отнести дегидратацию и внутриклеточную кристаллизацию. Оптимальная скорость охлаждения, специфичная для конкретного типа клеток, обеспечивает баланс трансмембранного массообмена «клетка - окружающая среда», в результате которого обезвоживание клеток, с одной стороны, является достаточным, чтобы исключить вероятность внутриклеточного льдообразования, а с другой - не достигает критического уровня, приводящего к неизбежному повреждению клеток. Существенную роль в этом процессе играют особенности строения плазматических мембран клеток, лимитирующих водный поток [22]. Целью настоящего исследования являлось установление оптимальных скоростей замораживания при криоконсервации спермы осетровых рыб, обеспечивающих сохранение структурных компонентов репродуктивных клеток. Материалы и методы исследований Материалом для исследований служили репродуктивные клетки русского осетра (Acipenser gueldenstaedtii Brandt&Ratzeburg, 1833) и стерляди (Acipenser ruthenus Linnaeus, 1758), полученные на осетровых рыбоводных заводах Астраханской области и Береговой научно-экспедиционной базе «Кагальник» Ростовской области в период нерестовой кампании. Качество спермы осетровых рыб на всех этапах процесса криоконсервации определяли по принятой методике [23]. Согласно этой методике качество партии спермы оценивают по количеству спермиев в 1 мл материала (тыс. шт.), по количеству подвижных сперматозоидов от общего числа (в %) и по времени активности сперматозоидов по 5-балльной шкале Г. М. Персова (1953) [24] с помощью микроскопа и видеоокуляра. Исходя из результатов ранее проведенных исследований, в массив этих косвенных показателей был введен еще один - время жизни спермиев после их активации [25]. Здесь качество биологического материала оценивали по времени с момента активации до полной остановки последнего сперматозоида в поле зрения микроскопа. Время подвижности регистрировали с помощью секундомера от начала движения до момента снижения активности сперматозоидов и до полной их остановки. Для криоконсервации использовали сперму активностью 4 и 5 баллов. Криоконсервацию репродуктивных клеток проводили по разработанной ранее методике с использованием наиболее оптимальной криосреды [26, 27]. Использовали специальное устройство, позволяющее проводить замораживание в автоматическом режиме по заданным значениям - криофризер. Сущность методики замораживания заключается в следующем. Замораживание биообъекта в парах азота происходит от начальной температуры до эвтектической. При достижении температуры значения криоскопической начинается этап кристаллообразования льда. Когда процесс кристаллообразования заканчивается, а температура по всему объему пробирки с биообъектом достигает эвтектической температуры, пробирку с биообъектом погружают в жидкий азот, продолжая ее замораживание до конечной температуры -196 оС. После этого пробирку с биообъектом оставляют в жидком азоте для длительного хранения. Из серии экспериментальных работ выбраны наиболее оптимальные скорости замораживания спермы осетровых рыб. Проведено исследование следующих скоростей замораживания: 3 ºС/мин, 10 ºС/мин и ступенчатый режим (6 ºС/мин в течение 6 мин, 10 ºС/мин в течение 4 мин, затем образцы погружали в жидкий азот). Размораживание спермы проводили на водяной бане при температуре 38-40 °С. Опыты проводили в трехкратной повторности, данные подвергали статистической обработке по Г. Ф. Лакину (1973) [28] и Ю. П. Адлер (1969) [29]. Результаты В первой серии экспериментов работы проводились со спермой русского осетра. Результаты представлены в табл. 1. Таблица 1 Исследование режимов замораживания спермы русского осетра Показатель 3 °С/мин 10 °С/мин Ступенчатый режим Активность, % Время жизни, с Активность, % Время жизни, с Активность, % Время жизни, с Нативная 97 ± 0,15 450 ± 0,50 97 ± 0,15 450 ± 0,50 97 ± 0,15 450 ± 0,50 После эквилибрации 89 ± 0,24 400 ± 0,60 70 ± 0,12 200 ± 0,51 53 ± 0,33 120 ± 0,38 Дефростированная 75 ± 0,11 360 ± 0,42 60 ± 0,23 130 ± 0,14 40 ± 0,12 70 ± 0,22 На рис. 1 представлены результаты влияния различных режимов замораживания на качество дефростированной спермы русского осетра. Рис. 1. Влияние скоростей замораживания на качество дефростированной спермы русского осетра Как видно из рис. 1, наилучшей скоростью замораживания для спермы русского осетра оказалась скорость 3 ºС/мин, как по активности, так и по времени жизни сперматозоидов после размораживания. Остальные режимы замораживания показали результаты хуже, однако необходимо учесть, что все три исследуемые скорости не снизили качество дефростированной спермы ниже рыбоводных показателей. Таким образом, все указанные скорости замораживания могут быть использованы при криоконсервации спермы этого вида рыб, в зависимости от тех или иных условий консервации. Аналогичные эксперименты проведены для стерляди. Результаты влияния режимов замораживания на репродуктивные качества спермы представлены в табл. 2, на рис. 2. Таблица 2 Исследование режимов замораживания спермы стерляди Показатель 3 °С/мин 10 °С/мин Ступенчатый режим Активность, % Время жизни, с Активность, % Время жизни, с Активность, % Время жизни, с Нативная 95 ± 0,21 300 ± 0,32 95 ± 0,21 300 ± 0,32 95 ± 0,21 300 ± 0,32 После эквилибрации 77 ± 0,17 250 ± 0,40 85 ± 0,15 270 ± 0,24 50 ± 0,16 100 ± 0,31 Дефростированная 65 ± 0,15 200 ± 0,22 80 ± 0,18 250 ± 0,19 30 ± 0,11 60 ± 0,13 Рис. 2. Влияние скоростей замораживания на качество дефростированной спермы стерляди При проведении работ со спермой стерляди меньшие повреждения после заморажива ния-оттаивания происходили при скорости заморозки 10 ºС/мин, в то время как при тех же режимах и сравнительно высоком качестве спермы для русского осетра оптимальной явилась скорость 3 ºС/мин. Скорость 3 ºС/мин для спермы стерляди оказалась несколько хуже. Ступенчатый режим замораживания оказался значительно хуже в обоих случаях. Выводы К основным факторам криоповреждений относят кристаллизацию вне- и внутриклеточной водной среды. Кристаллы в твердой фазе воды имеют не стационарный характер, а изменяются на ряде значений температур, меняя форму и размер, поэтому разрушения внутриклеточных структур имеют многоступенчатый характер. Установлено, что этих разрушений можно избежать, изменяя скорости замораживания и оттаивания объектов. Для осетровых рыб из испытываемых скоростей замораживания наиболее приемлемыми являются 3 ºС/мин для русского осетра и 10 ºС/мин для стерляди. Полученные результаты указывают на то, что выбор скоростного режима замораживания спермы осетровых рыб является видоспецифичным.