Усиление антропогенного прессинга на водные экосистемы обуславливает необходимость улучшения качества мониторинга процессов в водоемах. Одним из общепринятых методов наблюдения, выявляющих реакцию водных систем на воздействие внешних факторов, является биоиндикация, основанная на идентификации видового разнообразия сообществ. Сообщества беспозвоночных гидробионтов, вследствие высокого разнообразия и особенностей развития, достаточно эффективно используются в качестве объектов биоиндикации [1]. Более ста лет применяется метод оценки загрязнения водоема органическими веществами на основе сапробных характеристик видов индикаторов, разработанных преимущественно для европейских водоемов [2]. Однако при интерпретации полученных данных установлено, что в таких списках отсутствует значительная часть видов водоемов аридной зоны Казахстана, что препятствует оценке их экологического состояния [3]. Происходит это из-за недостаточно точной идентификации видов по морфологическим параметрам. Особенно это касается групп донных беспозвоночных, в том числе гетеротопных насекомых, представителей семейства Chironomidae (Diptera), ввиду метаморфоза стадий развития. Хирономиды являются отличными биологическими индикаторами здоровья водных экосистем, но внутривидовая их изменчивость, наряду с морфологическим сходством личиночных стадий разных видов, затрудняет определение организмов до видового ранга. Общепризнано, что для достоверного определения вида хирономид необходимо изучение всех стадий развития, что недоступно при обычной работе исследователя. Следствием является не в полной мере изученный видовой состав и использование устаревшей систематики [4, 5]. Часть высказанных замечаний относится и к таксономии планктонных беспозвоночных, особенно в водоемах аридных малоизученных регионов. Вместе с тем достоверность определения состава, обилия видов, видовых характеристик водных беспозвоночных необходима при использовании их как индикаторов экологического статуса водоемов. Для улучшения идентификации видов с трудной таксономией или их жизненных стадий в настоящее время применяют молекулярно-генетические методы. Широкое распространение получило использование последовательности участка гена СО1 митохондриальной ДНК (ДНК-штрих-кодирование, или ДНК-баркодинг) [6]. Использование фрагмента гена CO1 для идентификации видов животных быстро преодолело этап новизны и перешло к широкому распространению [7, 8]. По сравнению с доминировавшими ранее методами анализа белкового полиморфизма ДНК-барко-динг обеспечивает получение гораздо более полной картины генетической изменчивости. Во многих случаях вариабельные генетические маркеры позволяют обнаружить межвидовые или межпопуляционные генетические различия, не распознаваемые методами электрофореза белков [9, 10]. Цель исследований: провести генетическую идентификацию беспозвоночных планктона и бентоса - биоиндикаторов концентрации органических веществ в водоемах Казахстана. В Казахстане работы по генотипированию беспозвоночных гидробионтов ранее не проводились. Генетическая идентификация беспозвоночных позволит уточнить видовой состав биоиндикаторов, исключить невалидные названия, особенно у доминирующей в экосистемах группы хирономид. Комплексные морфологические и генетические работы могут стать основой региональной базы данных биоразнообразия беспозвоночных гидробионтов, необходимой для достоверной оценки экологического состояния водоемов Казахстана. Материал и методики исследования Разнообразие планкто- и бентофауны исследовалось при мониторинге рыбохозяйственных водоемов Балхаш-Алакольского бассейна - Алакольской системы озер, водохранилища Капшагай в среднем течении р. Иле на юго-востоке и р. Жайык (р. Урал) на западе Республики Казахстан. Для сопоставления результатов идентификации морфологического и молекулярно-гене-тического анализов беспозвоночных озер, водохранилищ и реки были проведены описанные ниже исследования. Отбор проб беспозвоночных на водоемах велся в мае и июне-августе 2015-2017 гг. стандартными орудиями лова: планктонными сетями Апштейна и Джеди, дночерпателем Петерсена и нектобентосным тралом [1, 11-13]. Материал фиксировался 40%-м формалином и параллельно, для ДНК-баркодинга, 96%-м этанолом. Выбранные из проб планктона и бентоса виды беспозвоночных идентифицировались морфологически [14-18]. Гидробионты, фиксированные спиртом, обрабатывались с применением методики ДНК-баркодинга [6]. Секвенирование проводилось с праймеров в обоих направлениях на генетическом анализаторе ABI PRISM 3130. Для выделения и последующей очистки ДНК беспозвоночных использовали метод абсорбции на колонках (PALL) c контролем качества выделения на спектрофотометре SPECTRAmax PLUS 384 [19]. Амплификацию и последующее секвенирование вели с использованием универсальных праймеров на CО1 митохондриальной (мт) ДНК [20]: - L 1490 - GGTCCAACAAATCATAAAGATATTGG; - H-2198TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA. Полимеразная цепная реакция (ПЦР-реакция) проведена в объеме 15 мкл (70 мМ Трис-HCl (pH 8.3)), 37,5 мМ (NH4)2SO4, 3 мМ MgCl2, по 100 мкМ каждого дезоксирибонуклеозидтрифосфата, по 1,5 пкМ каждого из праймеров, 1 ед. СolorTaq-полимеразы. Амплификация: предварительная денатурация ДНК: 95 °C - 10 мин, синтез ПЦР-продуктов (30 циклов), плавление - 94 °С - 20 с, отжиг праймеров - 48 °С - 40 с, синтез ДНК - 72 °С - 60 с, окончательная достройка цепей - 72 °С - 10 мин. Результат амплификации проверялся методом электрофореза в агарозном геле с окрашиванием бромистым этидием. Секвенирование гена СО1 митохондриальной ДНК проводилось с тех же праймеров в обоих направлениях на ABI PRISM 3100, c набором Big Dye v3.1, с последующим анализом и выравниванием последовательностей с помощью биоинформационного пакета программ Laser Gene 6.0 [21]. Для анализа были выбраны личинки Chironomidae и различные представители Crustacea - ракообразных. Ввиду расширения регионального списка видов-индикаторов сапробности водоемов учитывались как часто встречающиеся, так и редкие виды ценозов [22]. В ходе исследований 2015-2017 гг. на предмет уточнения таксономического статуса водных беспозвоночных методами ДНК-баркодинга проанализировано 33 вида. Результаты исследования и их обсуждение Алакольская система озер и водохранилище Капшагай находятся в аридной зоне Алакольской и Илейской межгорных котловин на юго-востоке Казахстана. Природно-климатические условия региона характерны для пустынной зоны [23]. Регион, исследуемый по р. Жайык, относится к зонам сухих и опустыненных степей. В озерной системе из трех озер наиболее крупное - оз. Алаколь (S = 2 650 км2, соленость 3 317-9 919 мг/дм3). Озера Сасыкколь (S = 736 км2) и Кошкарколь (S = 120 км2) - пресноводные, с минерализацией от 460 до 960 мг/дм3. Водохранилище Капшагай (V = 10,6-26,1 км3 в 2015-2016 гг.) - пресноводный водоем (303-517 мг/дм3). Результаты идентификации беспозвоночных гидробионтов морфометрически и путем секвенирования гена CО1 митохондриальной ДНК в указанных водоемах сведены в таблице. Идентификация видового состава беспозвоночных в водоемах Балхаш-Алакольского бассейна и реки Жайык, с привлечением генетического анализа - ДНК-баркодинга, и соответствие полученных последовательностей базам данных GenBank и BOLD, 2015-2017 гг. № п/п Морфологическое определение видов Последовательность с наибольшей гомологией из баз данных GenBank и BOLD Процент идентичности № сиквенса в GenBank и BOLD 2015 г. Зообентос. Водохранилище Капшагай 1 Procladius ferrugineus Kieffer Procladius ferrugineus voucher HP4 cytochrome oxidase subunit 1 (COI) gene, partial cds; mitochondrial 658/658 (99 %) KC250835.1 2 Chironomus gr. plumosus Linne Chironomus muratensis voucher HP9 cytochrome oxidase subunit 1 (COI) gene, partial cds; mitochondrial 598 /658 (99 %) KC250747.1 3 Cryptochironomus viridulus Fabricius Cladopelma virescens voucher HO6 cytochrome oxidase subunit 1 (COI) gene, partial cds; mitochondrial 630/658 (99 %) KC250758.1 Зоопланктон. Водохранилище Капшагай 4 Daphnia galeata Sars Daphnia galeata isolate G17/4 cytochrome oxidase subunit I (COI) gene, partial cds; mitochondrial 631/637 (99 %) GQ457332.1 Зообентос. Алакольская система озер 5 Paratanytarsus lauterborni Kieffer Paratanytarsus grimmii voucher BIOUG02981-A03 cytochrome oxidase subunit 1 (COI) gene 605/605 (100 %) KJ167465.1 2016 г. Зообентос. Водохранилище Капшагай 6 Procladius ferrugineus Kieffer Procladius ferrugineus voucher HQ3 cytochrome oxidase subunit 1 (COI) gene, partial cds; mitochondrial 529/530 (99 %) KC250836.1 7 Pontogammarus robustoides (Sars) Pontogammarus robustoides cytochrome oxidase subunit I (COI) gene, partial cds; mitochondrial 531/544 (98%) AY189508.1 Зообентос. Алакольская система озер 8 Procladius ferrugineus Kieffer Procladius ferrugineus cytochrome oxidase subunit 1 (COI) gene, partial cds; mitochondrial 601/664 99 %) KC250835.1 9 Cricotopus gr. silvestris Fabricius Cricotopus silvestris cytochrome oxidase subunit 1 (COI) gene, partial cds; mitochondrial 650/654 (99 %) KC250795.1 10 Ischnura pumilio (Charpentier) Ischnura elegans cytochrome oxidase subunit 1 (COI) gene, partial cds; mitochondrial 619/656 (95 %) KF369415.1 11 Procladius ferrugineus Kieffer Procladus sp. subunit 1 (COI) gene, partial cds; mitochondrial 565/594 (95 %) KJ208934.1 Зообентос. Река Жайык 12 Chironomidae (вид не определен) Lipiniella fujiprimus voucher gg376 cytochrome oxidase subunit 1 (COI) gene, partial cds; 609/612 (99 %) JF412078.1 13 Mysidae (вид не определен) Paramysis lacustris cytochrome oxidase subunit 1 (COI) gene, partial cds 601/606 (99 %) DQ779836.1 Зоопланктон. Алакольская система озер 14 Daphnia (D.) galeata Sars Daphnia galeata cytochrome oxidase subunit 1 (COI) gene, partial cds; mitochondrial 646/655 (99 %) EF375867.1 15 Moina brachiata (Jurine) Moina brachiata cytochrome oxidase subunit 1 (COI) gene, partial cds; mitochondrial 589/620 (98 %) JN641836.1 2017 г. Зообентос. Водохранилище Капшагай 16 Chironomus gr. plumosus Linne Chironomus plumosus voucher HS9 cytochrome oxidase subunit 1 (COI) gene, partial cds; mitochondrial 660/658 (98 %) KC250751.1 17 Palaemon modestus (Heller) Macrobrachium nipponense voucher GU_I138 cytochrome c oxidase subunit I (COI) gene, partial cds; mitochondrial 642/659 (100 %) KF547935.1 Окончание табл. № п/п Морфологическое определение видов Последовательность с наибольшей гомологией из баз данных GenBank и BOLD Процент идентичности № сиквенса в GenBank и BOLD Зообентос. Алакольская система озер 18 Chironomus gr. plumosus Chironomus balatonicus isolate SarUz cytochrome c oxidase subunit I (COI) gene, partial cds; mitochondrial 658/596 (100 %) JN016826.1 Зоопланктон. Водохранилище Капшагай 19 Thermocyclops crassus (Fisch.) Thermocyclops cf. taihokuensis WM-2017a mitochondrial COI gene for cytochrome c oxidase subunit I, partial cds, isolate: Thtai_01 633/658 (99 %) LC215458.1 20 Thermocyclops asiaticus = = Thermocyclops taihokuensis (Kiefer) Thermocyclops cf. taihokuensis WM-2017a mitochondrial COI gene for cytochrome c oxidase subunit I, partial cds, isolate: Thtai_01 658/658 (99 %) LC215456.1 21 Neutrodiaptomus (N.) incongruens (Poppe) Neutrodiaptomus (N.) incongruens 587 (99,48 %) Сиквенс в системе BOLD Молекулярный анализ нуклеотидных последовательностей гена цитохромоксидазы 1 мт ДНК показал, что 21 казахстанский вид гидробионтов соотносятся (на 98-100 %) с ранее опубликованными последовательностями беспозвоночных в общедоступной базе данных GenBank. Длина митохондриальных сиквенсов составляла 560-658 пар нуклеотидов (п. н.) Примерно половина указанных видов в таблице подтверждает определения специалистов по морфологическим показателям как имеющие высокое сходство с сиквенсами, депонированными в GenBank. По определенным родам хирономид (Cryptochironomus, Paratanytarsus, Chironomus) баркодингом приведены уточнения их видового статуса, установленного по морфологии особей. Например, личинка комара-звонца, определенная в различных исследованных водоемах как C. рlumosus, выявила генетическое сходство с последовательностями С. muratensis в вдхр. Капшагай, C. balatonicus в Алакольской системе озер и с последовательностями C. plumosus также в вдхр. Капшагай. Расхождение в видовом определении, возможно, обусловлено морфологическим сходством на личиночной стадии и трудностями морфологического определения. Такое явление очень часто встречается и связано с недостаточной изученностью морфологии региональных видов. Такие виды репродуктивно изолированы и хорошо отличаются по структуре геномов. Морфологическое сходство в большей степени проявляется у близких видов, обитающих раздельно (в аллопатрических популяциях), и уменьшается, если виды обитают в совместных популяциях (в симпатрии) [24]. Считается, что усиление морфологических различий между близкими видами из совместных поселений повышает их презиготическую репро-дуктивную изоляцию и препятствует межвидовой гибридизации, также играет важную роль в процессе видообразования. Образцы организмов зообентоса из групп Chironomidae и Mysidae р. Жайык не были определены до вида, но по нуклеотидным последовательностям митохондриального гена СО1 из GenBank, с 99 % гомологией, идентифицированы на видовом уровне. По четырем видам ПЦР амплификация не прошла, вероятно, имела место неправильная фиксация первичного материала. В качестве известных причин такого явления исследователи называют также длительную экспозицию воздействия дневного света и температуры, после которых ДНК не может быть успешно выделена для СО1-анализа [25]. Кроме того, имеются комплексы видов, таксономический статус которых не может быть установлен морфологическими методами. К ним относятся, в частности, виды родов Paratanytarsus и Psectrocladius. На рис. 1 и 2 приведены кладограммы, построенные Н. С. Мюге, по последовательностям гена CO1 исследованных видов для семейств Chironomidae и Moinidae из водоемов Балхаш-Ала-кольского бассейна (для последовательностей, полученных из базы данных NCBI GenBank, использованных для сравнения, указаны их идентификаторы (accession #)). Рис. 1. Кладограмма представителей семейства Chironomidae Рис. 2. Кладограмма семейства Moinidae. В качестве аут-группы использована последовательность Ceriodaphnia cf. reticulata (acc. # KC617252) Семейство Chironomidae на рис. 1 представлено десятью кладами различных видов, от очень близких между собой до совсем отдаленных. Это, например, близкая группа Procladius из озер Кошкарколь, Алаколь и вдхр. Капшагай и удаленная клада группы Polypedium. Связи между видами демонстрируют генетический полиморфизм, связанный с быстрыми темпами мутаций, в данном случае гена СО1 мт ДНК этих видов. Степень внутрипопуляционного генетического полиморфизма анализируемых видов позволяет судить об изменениях, претерпеваемых популяцией во времени и пространстве. Важно отметить, что недавно описана криптическая группа моин (Moina), ранее считавшаяся одним видом Moina brachiata [26, 27]. Казахстанский вид Moina brachiata из оз. Алаколь является тоже отдельным, ранее не описанным видом, наиболее близким к кладе «А» из работы [27], но тем не менее формирующим отдельную кладу на уровне 5 % отличий последовательности гена CO1. На рис. 2 представлены генетические связи между обнаруженным криптическим видом Moina из оз. Алаколь в группе других видов Moina. Всего представлено 4 группы моин, которые генетически расходятся на 2 основные клады, включая и казахстанский вид. Генетическая обособленность последнего, возможно, происходила под влиянием солености и глубины озера. Данные факторы являются важными при образовании и распространении криптических таксонов в роде Moina [28]. Общеизвестно, что различия в солености оказывают прямое воздействие на физиологию, которая, в свою очередь, влияет на видовой состав сообществ зоопланктона. Различия в глубинах также могут являться рефугиумами для защиты от визуальных хищников, что тоже может приводить к дифференциации криптических видов моин [29, 30]. Помимо видов, приведенных в таблице, у восьми видов беспозвоночных сходство нуклеотидной последовательности гена СО1 было менее 95 %, хотя все нуклеотидные последовательности гена СО1 мт ДНК представлены в диапазоне 570-660 п. н., что достаточно для корректной генетической идентификации животных. Данный факт может говорить о том, что в базе данных GenBank имеются не эти виды, а другие, разной степени близости к указанным. Такое положение в баркодинге казахстанских таксонов объясняется разнообразием анализируемых объектов и недостаточной генетической изученностью в многолетнем аспекте. Заключение Из результатов данной работы следует, что молекулярное ДНК-баркодирование беспозвоночных гидробионтов Казахстана требует продолжения, с охватом большего количества видов и в нескольких повторностях. Имеет смысл проводить генетический анализ по отдельным таксономическим группам, наиболее многочисленным в водоемах и важным в биоиндикации, таким как хирономиды в бентоценозе и ракообразные - в других сообществах водоемов. Важно отметить также, что для анализа последовательностей мт ДНК необходима качественная первичная фиксация объектов исследований и достаточное количество образцов. Несоблюдение этого правила может привести к существенным ошибкам при генетическом определении видов. Генетические различия (> 5 %) между особями, идентифицированными одними и теми же видами, но обитающими в разных частях водоемов, позволяют предположить существование криптических видов. Соответственно, возникнет и необходимость проведения дополнительной таксономической ревизии внутри этих таксонов. Многообразие и сложная морфоструктура беспозвоночных гидробионтов Казахстана неизбежно приводит к необходимости исследования точной таксономии видов с применением различных маркеров ядерной и митохондриальной ДНК. Это позволит пополнять библиотеку баркодинговых последовательностей новыми качественными и разнообразными данными. Вероятно, можно говорить о появлении более специализированных баз данных последовательностей ДНК, сгруппированных по таксономическому и экологическому признакам. По мере накопления генетической информации для массовых видов беспозвоночных определенного региона будет открываться перспектива проведения мониторинга различных видов при исследовании структуры природных сообществ. Вместе с тем ДНК-баркодинг не приходит на замену морфологическому методу определения видов беспозвоночных, а лишь является его дополнением.