Выращивание объектов аквакультуры в установках с замкнутым циклом водоснабжения считается наиболее прогрессивной рыбоводной технологией [1, 2]. В то же время изъятие любого животного из привычной системы экологических параметров и помещение его в искусственно созданные условия может нарушать общую направленность обмена веществ или отдельных биохимических реакций в процессе установления связи с новыми модифицирующими факторами внешней среды [3]. Показано, что в природных условиях функциональное состояние осетровых рыб строго подчиняется сезонным изменениям параметров водной среды и колебаниям массы кормовых ресурсов [4]. У осетровых, содержащихся в установках замкнутого водообеспечения (УЗВ) при интенсивном кормлении и постоянной температуре, происходит излишняя аккумуляция в гонадах липидных компонентов, что препятствует их нормальному созреванию. Для изменения динамики обменных процессов в нужном направлении в УЗВ понижают температуру воды [5-8]. В контексте этих работ для определения начала корректировки направленности метаболических процессов в целом и репродуктивного цикла сельскохозяйственных животных в частности уже давно используются биохимические показатели крови [9]. Однако методология применения биохимических показателей в целях управления процессом накопления и расходования материально-энергетических ресурсов для инициирования процесса созревания осетровых рыб в искусственных условиях продолжает оставаться предметом активных поисковых исследований [5, 10]. Ряд авторов для изучения активности метаболических процессов у рыб в период созревания гонад в природных условиях и при использовании в рыбоводном процессе исследовали показатели крови, характеризующие жировой, белковый и окислительный обмен [5, 10, 11]. Исследовалась вариабельность активности половых гормонов [12-15]. Скорость оседания эритроцитов (СОЭ), являясь неспецифическим физиологическим показателем, неоднозначно реагирует на репродуктивный цикл. Ранее был установлен диапазон вариабельности СОЭ - 2,0-4,0 мм/ч. Общими направлениями динамики СОЭ являются ее увеличение в процессе созревания рыб и снижение при окончательном созревании [5, 10, 16, 17]. Индикатором активности метаболических процессов в организме рыб является гемоглобин. Концентрация гемоглобина в крови осетровых варьировала в пределах 50,0-80,0 г/л. В период роста ооцитов его концентрация в крови возрастает, снижаясь на этапе завершения этого процесса. Низкое содержание гемоглобина в активной фазе формирования половых продуктов свидетельствует о нарушении генеративного обмена [5, 10, 18-22]. Важнейшим показателем функционального состояния рыб является сывороточный белок. Общий диапазон вариабельности сывороточного белка у осетровых находится в пределах 28,0-40,0 г/л. У самок осетровых, используемых в рыбоводных целях, при низком проценте оплодотворения икры или индифферентности по отношению к гипофизарной инъекции концентрация белка в крови высокая, что указывает на незавершенность процесса созревания. Патологически низкое содержание белка в крови свидетельствует об истощении рыб [5, 10, 18-22]. Развитие ооцитов проходит несколько стадий вителлогенеза. Предшественник основных компонентов желтка, липофосфопротеид (вителлогенин) синтезируется гепатоцитами печени и транспортируется кровью в ооциты [23-26]. В ходе миграции осетровых рыб на нерест уровень бета-липопротеидов, а параллельно и холестерина в крови, повышается. Общий диапазон вариабельности липопротеидов у осетровых - 2,0-10,0 г/л; холестерина 1,0-2,8 ммоль/л. Высокая вариабельность бета-липопротеидов и холестерина в преднерестовый период свидетельствует о значительной степени их использования в процессе формирования гонад [5, 10, 16-19, 22, 27-29]. Исследование водно-солевого обмена у осетровых рыб показало, что естественное созревание гонад вызывает у них изменения регуляции метаболизма воды и электролитов. Под действием стероидных гормонов уменьшается реабсорбция натрия и хлора в почечных канальцах [30]. Гормональная стимуляция созревания осетровых рыб, используемых в рыбоводном процессе, приводит к перераспределению воды в их организме, при этом снижается осмоляльность крови и повышается осмоляльность мочи [10, 31]. Изучению механизмов, регулирующих функционирование генеративного обмена у рыб, посвящено значительное количество работ. Актуальным аспектом исследования репродуктивной физиологии рыб продолжает оставаться гормональная регуляция самых ранних фаз развития половых желез [12-13, 32-36]. Установлено, что репродуктивная функция рыб регулируется двумя гипофизарными гонадотропными гормонами ГТГ-I и ГТГ-II. Также показано, что ГТГ-I стимулирует развитие и функционирование соматической, а ГТГ-II - генеративной части гонады. Снижение чувствительности овариальных фолликулов к гормонам, наблюдаемое особенно в конце сезона размножения, четко коррелирует с изменениями в ультраструктуре клеток фолликулярного эпителия [34]. Предельно истощенные после нереста в природных условиях производители осетровых мигрируют в море и под действием всего спектра привычных для них экологических условий в определенный момент начинают вновь формировать половые продукты [4]. При содержании производителей осетровых и их гибридов в УЗВ подобных экологических условий нет и, прежде всего, отсутствуют сезонная цикличность и многообразие кормовых ресурсов. При постоянно высокой температуре и регулярном питании высококалорийным кормом осетровые по завершении генеративного процесса не истощены, как рыбы-миг-ранты, и не нуждаются в длительном периоде аккумуляции материально-энергетических ресурсов и гормонов гипоталамо-гипофизарной нейросекреторной системы для нового этапа процесса размножения рыб [35, 37, 38]. Ранее было показано, что процесс первичного созревания и длительность межнерестовых интервалов у осетровых рыб и их гибридов при выращивании в контролируемых условиях поддается управлению. Рилизинг-гормоны вентрального гипоталамуса, воздействуя на центральную нервную систему, гипофиз и комплекс висцеральных органов, инициируют нерестовое поведение, способствуют овуляции и спермации, а после завершения нереста участвуют в поддержании метаболического равновесия. Однако в контексте изложенного остается потребность верифицировать биохимические реакции и структурные преобразования яичников, которые происходят в организме гибридов осетровых, содержащихся в УЗВ, в самом начале цикла формирования половых продуктов, индуцированных градуальными инъекциями синтетического аналога гормона люлиберина - сурфагоном [35, 38]. Данное исследование посвящено изучению вариабельности биохимических показателей крови и мочи, характеризующих интенсивность и направленность генеративного обмена и соответствующих им структурных преобразований яичников, индуцированных сурфагоном, у самок русско-ленского осетра с низкой упитанностью. Материалы и методы исследований Исследование было выполнено в 2017 г. в лаборатории водных биоресурсов и аквакультуры на базе научно-экспедиционной базы «Кагальник» Южного научного центра РАН и инновационного центра «Биоаквапарк - научно-технический центр аквакультуры» Астраханского государственного технического университета. В качестве объекта исследования использованы половозрелые не нерестившиеся самки гибрида русский осетр × ленский осетр (далее русско-ленский осетр) в возрасте 5 лет средней массой 632 г, длиной 58,2 см и низкой упитанностью (по Фультону) 0,32 ед. [39]. Экспериментальную рыбу содержали в УЗВ с постоянным термическим и гидрохимическим режимом: температурой воды 22-24 °С, насыщением воды кислородом 70,0-80,0 %, значением рН 7,5-7,9. До начала экспериментальных работ рыба длительное время содержалась в бассейне объемом 15 м3 с замкнутой системой водоснабжения совместно с крупными производителями осетровых. Температура воды в этом бассейне колебалась в пределах 10,0-21,0 °С. На фоне относительно низких температур, тотального дефицита корма и высокой плотности опытные рыбы не смогли реализовать соответствующие возрасту потенциальные возможности пластического и генеративного обмена. Известно, что в оптимальных температурных условиях (22,0-24,0 °С) и при соответствующем кормлении самки гибрида русско-ленского осетра в возрасте 5 лет могут впервые созреть и достигнуть средней массы 7 кг. При работе с осетрами в УЗВ прослеживается определенная связь периодичности размножения с размерами осетровых рыб [2, 38]. Исследование проводили в пластиковых бассейнах системы замкнутого водообеспечения (1 × 1 м) на трех группах рыб на протяжении 10 дней. Одна группа осетров выступала в качестве контрольной, две другие - опытных. Кормление осуществляли продукционным комбикормом фирмы «БИОМАР» № 3-4. Суточную норму кормления определяли в зависимости от массы тела и температуры воды по специальным кормовым таблицам [40]. Инъекцирование проводили через равные промежутки времени (табл. 1). Таблица 1 Схема использования синтетического аналога гормона люлиберина (сурфагон) в эксперименте Группа Концентрация сурфагона, мкг/кг массы Группа 1 (контроль) - Группа 2 0,2 Группа 3 2,0 Для анализа гематологических показателей кровь у рыб брали прижизненно из хвостовой вены с помощью медицинского шприца. Физиологическое состояние оценивали по содержанию в крови гемоглобина, СОЭ, сывороточного белка, бета-липопротеидов, холестерина. Концентрацию гемоглобина в крови определяли фотометрически с помощью набора реактивов фирмы «Агат-Мед» [41], СОЭ - по методу Панченкова, содержание сывороточного белка - с помощью рефрактометра ИРФ-22 [42, 43]. Уровень холестерина в крови оценивали энзиматическим методом с использованием набора реактивов фирмы «Ольвекс Диагностикум» [44], количество бета-липопротеидов - по методу Бурштейна [45]. Осмоляльность сыворотки крови и мочи определяли криоскопическим методом на осмометре ОСКР-1. Анализ морфофункционального состояния половых желез проводился стандартными гистологическими методами [46]. Половые железы были зафиксированы в 10,0 % формалине. Для просмотра препаратов использовался микроскоп OLYMPUS ВХ40, а для изготовления микрофотографий - цифровая камера-окуляр для микроскопа DCM500. Экспериментальный материал обработан вариационно-статистическими методами [47]. Анализ осуществляли с помощью критерия t-Стьюдента. Результаты исследований Исследование скорости оседания эритроцитов у всех экспериментальных групп русско-ленского осетра, включая инъецированных сурфагоном, выявило высокую вариабельность СОЭ (рис. 1). Рис. 1. Вариабельность СОЭ у русско-ленского осетра под влиянием инъекций сурфагона Установленная ранее у других видов осетровых рыб тенденция к увеличению СОЭ при введении гормонов гипофиза и овуляции половых продуктов показана и у русско-ленского осетра, но она не подтверждена статистической достоверностью [17]. Прямо противоположно динамика СОЭ у русско-ленского осетра соотносилась с динамикой осмоляльности сыворотки крови. В начале эксперимента ее величина снижалась, а затем увеличивалась у рыб как в контрольной, так и в опытных группах. После инъекции сурфагона в дозе 2,0 мкг/кг при аналогичной тенденции выявить достоверные различия не удалось (табл. 2). Таблица 2 Вариабельность осмоляльности сыворотки крови и мочи у русско-ленского осетра под влиянием инъекций сурфагона Показатель Период исследования, сут Группа 1 Группа 2 Группа 3 M ± m V, % M ± m V, % M ± m V, % Сыворотка крови 0 254,00 ± 8,55* 5,00 260,00 ± 1,78** 1,00 258,00 ± 3,90 2,00 5 196,00 ± 19,00* 13,00 233,00 ± 6,42** 6,00 234,00 ± 21,00 12,00 10 261,00 ± 2,12* 2,00 256,00 ± 1,47** 1,00 252,00 ± 4,42 16,00 Моча 0 101,00 ± 13,47** 19,00 70,00 ± 24,50 49,00 102,00 ± 3,74** 5,00 5 30,00 ± 3,54 17,00 75,00 ± 20,00 37,00 41,00 ± 1,48** 2,00 10 30,00 ± 7,07** 33,00 33,30 ± 10,80 10,80 25,33 ± 9,1** 51,00 *р ≤ 0,01; **р ≤ 0,001. С высокой степенью достоверности у самок русско-ленского осетра снижалась осмоляльность мочи. Противоположная тенденция выявлена ранее у самок гибрида стерлядь × белуга с высокими массовыми характеристиками. В процессе репродуктивного цикла у этих рыб осмоляльность мочи росла параллельно увеличению степени зрелости половых продуктов и снижалась только после искусственной зимовки, т. е. после завершения репродуктивного цикла [17]. Таким образом, у самок русско-ленского осетра, не достигших к пятилетнему возрасту необходимых массовых характеристик, не выявлено очевидных признаков влияния сурфагона на динамику показателей, характеризующих водно-солевой обмен. Достоверная вариабельность характеризующих его показателей, вероятно, определилась комплексным воздействием всех факторов, включая исходное физиологическое состояние рыб и экологию окружающей среды. У контрольной и опытных групп русско-ленского осетра, характеризующихся низкой упитанностью, концентрация гемоглобина в крови находилась в пределах нижней границы диапазона (50,0-80,0 г/л), установленного для рыб в процессе нерестовой миграции в природных условиях (рис. 2). Рис. 2. Уровень гемоглобина у самок русско-ленского осетра под влиянием инъекций сурфагона Ранее было показано, что у производителей осетровых рыб, выдерживаемых в искусственных условиях при нерестовых температурах, отмечается низкий уровень гемоглобина. Вероятно, в отсутствие миграционного периода потребность в дополнительной энергии у этих рыб снижается [5, 10, 21, 48, 50]. У самок гибрида стерлядь × белуга, ранее использованных в рыбоводном цикле и характеризующихся высокими массовыми характеристиками, выявлена аналогичная тенденция до начала искусственной зимовки. После зимовки уровень гемоглобина достоверно увеличивался в связи с потребностью в дополнительной энергии для окончательного завершения процесса формирования гонад [10]. У всех групп русско-ленского осетра, характеризующихся слабой упитанностью, выявлена исключительно низкая концентрация белка в крови (рис. 3). Рис. 3. Вариабельность общего сывороточного белка у русско-ленского осетра под влиянием инъекций сурфагона Ранее установленный более высокий диапазон варьирования значений этого показателя (28,0-40,0 г/л) наблюдался у производителей осетровых рыб с высокими массовыми характеристиками из естественных водоемов и при использовании на рыбоводных заводах, включая гибридов. У производителей (как в природной среде, так и при рыбоводном освоении) концентрация белка в крови увеличивается при созревании гонад. У истощенных рыб отмечен исключительно низкий уровень белка 17,0-21,0 г/л [5, 10, 16]. У экспериментальных рыб при низком исходном уровне белка и воздействии сурфагоном выявлена статистически недостоверная тенденция к его увеличению. Исключительно низкой концентрации сывороточного белка у контрольных и опыт-ных групп русско-ленского осетра соответствовала относительно высокая концентрация бета-липопротеидов (табл. 3). Таблица 3 Вариабельность бета-липопротеидов в крови у самок русско-ленского осетра под влиянием инъекций сурфагона Показатель Вариабельность бета-липопротеидов, г/л 0 сут 5 сут 10 сут Группа 1 М ± m 4,37 ± 1,43 5,52 ± 1,19 3,94 ± 0,29 V, % 46,00 30,00 10,00 Группа 2 М ± m 2,21 ± 0,34* 4,58 ± 1,10** 5,71 ± 0,77** V, % 22,00 34,00 19,00 Группа 3 М ± m 2,74 ± 0,31* 4,80 ± 0,76* 6,62 ± 1,56* V, % 16,00 22,00 33,00 *р ≤ 0,05; **р ≤ 0,001. Анализ вариабельности бета-липопротеидов у опытных самок гибрида русско-ленского осетра в вариантах с инъекцией сурфагона в дозах 0,2 и 2,0 мкг/кг выявил ранее установленную тенденцию к увеличению транспорта этого биохимического субстрата у осетровых рыб при естественном созревании рыб в ходе нерестовой миграции [27]. Аналогичная тенденция выявлена у рыб при использовании на рыбоводных заводах по традиционной технологии. Индифферентные к гормональной стимуляции рыбы имели повышенный уровень бета-липопротеидов и белка в крови. Истощенные рыбы характеризовались низким содержанием их в крови. В первом случае производители имели полный набор материально-энергетических ресурсов, но не достигли функциональной кондиции для реализации гонадотропной функции. У второй группы рыб на фоне низкого уровня транспорта белка и бета-липопротеидов таковых запасов не было [5]. Исследованные ранее самки гибрида стерлядь × белуга с высокими массовыми характеристиками имели нормальный уровень бета-липо-протеидов на фоне высоких значений сывороточного белка в крови. В процессе созревания эти рыбы дали положительный рыбоводный результат [10]. Менее интенсивно у опытных групп русско-ленского осетра, которым выполнялись инъекции сурфагона в различных дозах, активизировался транспорт в крови холестерина (табл. 4), являющегося предшественником гормонов и участвующего в формировании ооцитов [49]. Таблица 4 Вариабельность холестерина в крови у самок русско-ленского осетра под влиянием инъекций сурфагона Показатель Вариабельность холестерина в крови, г/л 0 сут 5 сут 10 сут Группа 1 М ± m 1,94 ± 0,49 1,91 ± 0,28 2,06 ± 0,13 V, % 36,00 21,00 9,00 Группа 2 М ± m 1,35 ± 0,21 1,90 ± 0,27* 2,30 ± 0,29* V, % 22,00 20,00 18,00 Группа 3 М ± m 1,36 ± 0,18 1,61 ± 0,22* 2,21 ± 0,20* V, % 18,00 20,00 13,00 *р ≤ 0,01. Выявленная тенденция оказалась статистически достоверной. У диких производителей в период нерестовой миграции концентрация холестерина в крови, от начала активного созревания до завершения процесса, увеличивается более чем в 2 раза [16]. Самки гибрида стерлядь × белуга, исследованные ранее, с высокими массовыми характеристиками, высоким уровнем сывороточного белка и бета-липопротеидов, имели нормальный уровень транспортируемого кровью холестерина [10]. Опытная группа русско-ленского осетра с исключительно низкими для данной возрастной группы массовыми характеристиками имела определенный тип биохимического статуса, когда при низком уровне материально-энергетических ресурсов физиологически реагировала на гормональную стимуляцию гонадотропного процесса. Гистологическое исследование гонад контрольной и опытных групп русско-ленского осетра показало, что у всех рыб завершена цитоморфологическая дифференциация пола (рис. 4). а б в Рис. 4. Морфологическая картина контрольных особей (а - самка 1; б - самка 2; в - самка 3) русско-ленского осетра (окраска кислым фуксином с докраской по Маллори; увеличение 22 × 4) г д е ж з Рис. 4 (окончание.) Морфологическая картина опытных особей (г - самка 5; д - самка 6; е - самка 7; ж - самка 8; з - самка 9) русско-ленского осетра (окраска кислым фуксином с докраской по Маллори; увеличение 22 × 4) Уровень развития яичников большинства самок соответствовал второй стадии зрелости гонад. В яичниках хорошо выражены яйценосные пластинки, заметные визуально. Среди половых клеток преобладали ооциты фазы однослойного фолликула (протоплазматического роста). У всех самок имелись деформированные ооциты, часть из которых дегенерировали. В минимальной степени это было выражено у самок № 2 и № 6. Наиболее развиты оказались железы у самки № 5, в периферическом слое цитоплазмы отдельных ооцитов старшей генерации которой имелись скопления мелких гранул желтка. В единичных икринках они располагались почти по всей поверхности цитоплазмы. В целом степень зрелости этого яичника можно оценить как II-III [51]. Гистологический анализ экспериментальных рыб показал, что выраженного различия в уровне развития половых желез между контрольной и опытной группами рыб не выявлено. Заключение Таким образом, у экспериментальных особей русско-ленского осетра, имеющих для данной возрастной категории исключительно низкую упитанность, характерную для производителей осетровых рыб после нереста в природных условиях, под влиянием сурфагона выявлена активизация транспорта в крови белка, бета-липопротеидов и холестерина - важнейших биохимических компонентов процесса формирования половых продуктов. В период нормального репродуктивного цикла осмоляльность сыворотки крови снижается, а осмоляльность мочи растет параллельно увеличению степени зрелости половых продуктов. У экспериментальных рыб этот процесс идет в обратном направлении. Группы рыб, инъецированные сурфагоном, имели определенный тип биохимического статуса, когда при низком уровне материально-энергетических ресурсов реагировали на гормональную стимуляцию, кардинально не меняя морфологию гонад. Вероятно, в условиях дефицита кормов материально-энергетические ресурсы, потребляемые рыбой, должны идти в первую очередь на генетически обусловленные объемы массы, по достижении которой начинается полноценное формирование гонад. Поэтому управление функциональной направленностью биохимических реакций в процессе формирования половых продуктов у осетровых рыб в УЗВ с применением искусственных кормов должно осуществляться через гормональное регулирование темпа первоначального накопления оптимальной массы тела с прицелом на дискретное формирование соматической и генеративной части гонад с учетом генетически обусловленных потенций исходных видов.