Глобальной проблемой современной экологии является сокращение биоразнообразия. Из-за антропогенного воздействия происходит интенсивное обеднение природы. За последнее столетие с лица Земли исчезло до 25 тыс. видов высших растений и более 1 тыс. видов позвоночных животных [1]. В настоящее время охрана природы является одной из самых важных и имеющих мировое значение проблем. Без специальных мер охраны некоторые виды животных выжить не могут, и количество таких видов, в частности видов рыб, увеличивается с каждым годом. Скорость сокращения видов устойчиво растет. Так, с 1600 по 1975 г. вымерло примерно 1,2 % животных, а к концу 1980-х гг. под угрозой вымирания находилось не менее 1 000 видов, что составляет около 8 % животных, обитающих на планете Земля. Сохранение такой тенденции может привести к тому, что к 2050 г. исчезнет до 50 % видов [2]. Природные и антропогенные факторы привели к тому, что многие виды рыб находятся на грани исчезновения, некоторые отнесены к разряду редких и исчезающих и внесены в Красные книги. Например, осетровые, белорыбица и другие популяции находятся в крайне депрессивном состоянии. В начале ХХ столетия стада осетровых рыб сохранялись в Азово-Черноморском и Каспийском бассейнах, а к началу XXI в. небольшое стадо осталось лишь в Каспийском море, но и оно исчезает быстрыми темпами. Именно поэтому особое беспокойство вызывает состояние осетровых рыб в этом регионе, где сосредоточено свыше 90 % мировых запасов. Из-за резкого сокращения природных запасов Россия уже 10 лет не ведёт промышленного лова осетровых рыб, остальные прикаспийские государства приняли мораторий на отлов этих рыб в последние 2-3 года [3]. В отсутствие естественного воспроизводства осетровых рыб важная роль отводится искусственному воспроизводству, которое в 1970-1980-х гг., после зарегулирования рек, имело основное значение в восстановлении численности природных популяций осетровых рыб [3]. Но и искусственное воспроизводство не способно полностью восстановить популяции в естественных водоемах. Актуальность разработки и создания новых, экономически эффективных биотехнологий для аквакультуры и сохранения биоразнообразия гидробионтов возрастает. Особенно они необходимы для решения задач по спасению редких и исчезающих видов рыб. Для восполнения сократившегося количества каспийских и азовских осетровых, сохранения и увеличения их промысловых запасов необходимо стремительное развитие искусственного воспроизводства осетровых, формирование высокопродуктивных маточных стад редких и исчезающих видов [4, 5]. Однако в настоящее время на рыбоводных заводах, вследствие дефицита производителей, наблюдается упрощенный подход к формированию маточных стад - использование близкородственных пар при скрещивании, что негативно влияет на качество потомства и структуру популяционного генофонда. Существующие технологические схемы аквакультуры недостаточно эффективны. В случае массовых заболеваний, стихийных бедствий и техногенных катастроф рыбоводные заводы и рыбопитомники, хозяйства марикультуры окажутся неспособными обеспечить производство посадочного материала в необходимых количествах. Кроме того, для восстановления их работы потребуются значительные время и средства. Работа рыбоводных заводов по воспроизводству естественных популяций осложняется недостатком полноценных производителей рыб, особенно осетровых [6]. Широкие перспективы для сохранения и рационального использования генетических ресурсов открывает технология криоконсервации репродуктивных клеток животных, в том числе рыб. Прогресс в области криобиологии, биологии развития, популяционной генетики и селекции рыб, а также в других областях науки позволяет приступить к созданию новых технологий аквакультуры, отличающихся более высокой экономической эффективностью и стабильностью. Важнейшим направлением этой деятельности являются формирование и содержание генофондных коллекций - как живых, так и сохраняемых в виде криоконсервированного репродуктивного материала, главным образом спермы. В настоящее время криотехнологии являются стратегически важными, в том числе антикризисными технологиями, для решения проблем, связанных с сохранением генетического биоразнообразия рыб. Использование криоконсервированной спермы на заводах по искусственному воспроизводству, а также на предприятиях аквакультуры позволит сформировать генетически разнородное стадо, сократит площади и затраты на содержание самцов, следствием чего станет увеличение продукционного стада самок. Применение криоспермы возможно в любое время, без риска несвоевременного созревания производителей или получения от них половых продуктов ненадлежащего качества [7-20]. В связи с вышеизложенным целью исследования являлось изучение возможности создания маточного стада стерляди с использованием криоконсервированных репродуктивных клеток. Материалы и методы исследований Исследования проводились на научной базе поселка Кагальник Ростовской области с использованием уникальной научной установки № 73602 и Биоресурсной коллекции редких и исчезающих видов Южного научного центра РАН. Объектом исследований служили репродуктивные клетки (в том числе криоконсервированные), личинки, молодь стерляди (Acipenser ruthenus Linnaeus, 1758). Оценку качества спермы проводили методом микроскопирования с использованием шкалы Г. М. Персова (1953) [21] - регистрировали процентное соотношение спермиев с поступательным и колебательным движением и общего количества живых сперматозоидов, время жизни спермиев после их активации фиксировали с помощью секундомера [22]. Оплодотворение икры проводили по стандартной технологии [23]. В эксперименте использовали самку стерляди, от которой получили икру способом, разработанным С. Б. Подушкой (1986) [24]. Партию икры поделили пополам - одну часть оплодотворили нативной спермой, вторую - дефростированной от двух самцов, которая хранилась в жидком азоте в течение трех лет. Масса самки, взятой для проведения эксперимента по искусственному оплодотворению, составила 1,7 кг, рабочая плодовитость - 20 000 шт. икринок, масса икры - 156 г. Половину икры оплодотворили нативной спермой (активность 95 %, время жизни 620 с) из расчета 10 мл/кг. Вторую половину оплодотворили дефростированной спермой (активность 70 %, время жизни 390 с). Так как при проведении криоконсервации и подготовительных работ к процессу оплодотворения сперма разбавляется в 4 раза, то дефростированной спермы было взято из расчета 40 мл/кг. Обесклеивание икры осуществляли в аппаратах обесклеивания икры (АОИ) речным илом в течение 40 минут. После отмывки икра была заложена на инкубацию в аппарат «Осетр», разделенный на две секции - контрольную и опытную. Аппарат установили в рыбоводный бассейн 1 × 1 с замкнутым циклом водоснабжения. Через сутки определяли процент оплодотворения [23]. В процессе инкубации контролировали гидрохимические показатели воды (температуру, насыщение воды кислородом, рН и др.). Во избежание заражения сапролегнией икру обрабатывали органическим красителем (фиолетовый К). Учет вылупившихся предличинок в контрольной и опытной ячейках аппарата «Осетр» осуществляли сплошным поштучным методом. Затем часть предличинок (по 500 шт. от каждой партии) была отобрана для дальнейшего наблюдения и посажена на выдерживание в аквариумы из органического стекла объемом по 200 л. В период выдерживания поддерживались оптимальные условия среды. После перехода на смешанное питание в аквариумы вносили живой корм - науплии артемии салина (Artemia salina). Для подращивания молоди опытной и контрольной партий использовали пластиковые бассейны ИЦА-2 в системе замкнутого водоснабжения. Молодь кормили живым кормом. В этот контролировали состояние молоди и фиксировали отход в обеих партиях. Через 10 суток после перехода молоди на активное питание обе партии молоди стерляди подвергали тестированию по методике «открытое поле» [25]. В качестве высокочастотного акустического раздражителя использовали удар частотой 800-2 000 Гц. Такие сигналы воспринимаются рыбами внутренним ухом. Следующим показателем был низкочастотный сигнал 20-150 Гц, который воспринимается боковой линией рыб. Еще один раздражитель - свет мощностью 250-300 люкс - воздействует на зрительные доли головного мозга. Опыты проводили в трехкратной повторности, данные подвергали статистической обработке по Г. Ф. Лакину (1973) [26] и Ю. П. Адлер (1969) [27]. Результаты исследования Степень оплодотворения икры в контрольной партии составила 90 %, в опытной партии - 70 %. Процесс инкубации продолжался 5 суток. В этот период очень важную роль играет температурный режим. Температура воды в период инкубации составила 14,5-18,3 °С, суточные колебания в среднем - 1,9 °С. Эмбриональное развитие икры в контроле шло с небольшим опережением по сравнению с опытом, длительность эмбриогенеза в опыте укладывалась в пределы установленных норм. Процесс вылупления предличинок в контроле начался на один час раньше, чем в опыте и составил 75 и 60 % соответственно от икры, заложенной на инкубацию. За период выдерживания предличинок до перехода на смешанное питание отмечался незначительный отход - 2,0 % в контроле и 3,4 % в опыте. Морфометрические показатели предличинок представлены в табл. 1. В конце периода выдерживания предличинки исследуемых партий незначительно отличались по морфометрическим показателям, т. е. различий в раннем онтогенезе выявлено не было. Достоверные различия были отмечены только в длине желточного мешка, что может указывать на большее содержание питательных веществ у группы личинок в опыте в конце периода выдерживания. Это свидетельствует о более интенсивном протекании обменных процессов в контроле по сравнению с опытом. Таблица 1 Морфометрические показатели предличинок стерляди Показатель Массовый выклев Переход на смешанное питание Контроль Опыт Контроль Опыт Масса, мг 12,32 ± 1,03 12,60 ± 0,82 23,61 ± 1,26 26,42 ± 6,2 Длина, мм 8,50 ± 0,25 8,58 ± 0,16 14,07 ± 0,94 14,59 ± 1,13 Длина желточного мешка, мм 3,28 ± 0,07 3,21 ± 0,10 2,43 ± 0,24* 2,89 ± 0,38* Высота желточного мешка, мм 2,36 ± 0,14 2,38 ± 0,14 2,18 ± 0,23 2,47 ± 0,30 * Различия достоверны при р ≤ 0,05. Можно сделать предположение, что партия в опыте развивалась более сбалансированно, чем контрольная. Это согласуется с теорией этапности развития В. В. Васнецова (1953) [28]. Суть этой теории заключается в том, что в течение различных периодов онтогенеза развитие рыб идет не только постепенно и непрерывно, но и прерывисто, скачкообразно, сопровождясь резкими изменениями в строении систем органов. Эти морфологические изменения неразрывно связаны с изменениями биологических особенностей рыб. Следует отметить, что те организмы, которые по отдельным показателям опережают им подобные, меняют свое качество быстрее и являются более приспособленными к последующим условиям среды обитания [23, 29]. Видимо, личинки в опыте оказались более приспособленными к переходу на активное питание, чем особи в контроле. Таким образом, личинки, полученные из дефростированной спермы, которая хранилась в жидком азоте, развивались нормально и не имели существенных отличий от личинок контрольной партии. После перехода на активное питание в период подращивания в течение 10 суток отход составил в контроле 3,6 %, в опыте - 5,4 %. Морфометрические показатели молоди представлены в табл. 2. Таблица 2 Морфометрические показатели молоди стерляди Показатель Начало подращивания Конец подращивания Контроль Опыт Контроль Опыт Масса, мг 23,61 ± 1,26 26,42 ± 6,2 44,73 ± 13,92* 56,5 ± 13,75* Длина, мм 14,07 ± 0,94 14,59 ± 1,13 21,27 ± 1,33 21,02 ± 1,71 * Различия достоверны при р ≤ 0,05. Согласно данным табл. 2, подрощенная молодь, полученная с использованием криоконсервированной спермы, набрала бóльшую конечную массу, чем молодь, полученная обычным способом. Таким образом, глубокая заморозка спермы стерляди и ее хранение в жидком азоте при температуре -196 °С в течение трех лет не оказывает негативного влияния на качество дефростированных половых клеток, а также на эмбриональное развитие и морфометрические показатели личинок и молоди стерляди. Очевидно, что использование дефростированного материала для искусственного осеменения икры целесообразно в условиях недостатка производителей на осетровых рыбоводных предприятиях. Сравнение изменений двигательной активности молоди стерляди, выращенной из нативной и дефростированной спермы, в ответ на различные раздражители - один из основных показателей пригодности технологии криоконсервации для использования в аквакультуре. По литературным данным [25, 30-32], одна из основных причин гибели заводской молоди после выпуска в естественные водоемы - ее интенсивное выедание хищниками, которое практически не зависит от размера молоди, но связано со слабым развитием у таких рыб оборонительного поведения и способности быстро реагировать на внешние раздражители. Результаты биологического тестирования молоди стерляди, полученной с использованием нативной и криоконсервированной спермы, представлены в табл. 3. Таблица 3 Изменение поведения молоди стерляди в исследуемых группах Показатель Контроль Опыт Ориентировочная активность 18,91 ± 5,1 17,87 ± 8,1 Фоновая активность 14,11 ± 3,7 18,75 ± 8,95 Низкочастотный раздражитель 16,61 ± 8,3 20,23 ± 8,9 Высокочастотный раздражитель 15,07 ± 8,6 18,86 ± 6,05 Свет 10,85 ± 5,9 13,80 ± 8,2 Статистическая обработка показала, что между партиями в контроле и опыте нет достоверных различий ни в одном тесте. По средним значениям построен график изменения реакций молоди стерляди в ответ на разные воздействия (рис. 1). Рис. 1. Изменение двигательной активности молоди стерляди по результатам теста «открытое поле» Отсутствие различий в поведении молоди в обеих партиях свидетельствует о нормальном развитии центральной нервной системы (ЦНС) стерляди. Однако необходимо проследить динамику реакций на раздражители (рис. 2). Рис. 2. Динамика двигательной активности молоди стерляди в опыте и контроле: ОА - ориентировочная активность; ФА - фоновая активность; Р1 - высокочастотный раздражитель (800-2 000 Гц); Р2 - низкочастотный раздражитель (20-150 Гц); Р3 - свет мощностью 250-300 люкс На все тестовые раздражители реакция молоди в опыте несколько превышала реакцию в контроле. Динамика реактивности исследуемых групп свидетельствует о том, что в контрольной группе рыбы более возбудимы (ориентировочная активность, фоновая активность). Именно это является причиной более низких ответных реакций при возбуждении органа слуха (высокочастотный раздражитель) и рецепторов боковой линии (низкочастотный раздражитель). Заключение В ходе исследования были получены следующие результаты: - потомство, полученное с использованием криоконсервированной спермы, которая хранилась в жидком азоте в течение трех лет при температуре -196 °С, имело нормальное эмбриональное и постэмбриональное развитие; существенных отличий от потомства в контрольной партии отмечено не было; - по морфометрическим показателям, в частности по конечной массе, подрощенная молодь в опыте немного превосходила молодь в контроле; - реактивность ЦНС «криомолоди» по итогам теста «открытое поле» не отличалась от реактивности ЦНС молоди контрольной партии. Вместе с тем динамика двигательной активности демонстрировала более интенсивную реакцию молоди в опыте на раздражители, что имеет большое значение при адаптации молоди к условиям естественных водоемов. Таким образом, применение криоконсервированной спермы для искусственного оплодотворения икры не оказывает существенного влияния на качество потомства, что подтверждает целесообразность использования методов низкотемпературного консервирования для воспроизводства и формирования ремонтно-маточных стад на рыбоводных предприятиях.