Введение Гипотермическое хранение спермы рыб (при пониженной температуре, но без замораживания) значительно уступает по длительности криоконсервации, но вместе с тем обладает важным преимуществом - не требует специального криогенного оборудования и материалов (жидкий азот, сухой лед). Это дает возможность применять гипотермическое хранение в полевых условиях, упрощает и делает безопасной транспортировку, в том числе авиационную, позволяет решать задачи синхронизации созревания половых продуктов при проведении нерестовых кампаний. Для гипотермического хранения спермы осетровых рыб наиболее обычным способом является помещение ёмкостей с неразбавленной спермой на холод - на ледяную баню или в холодильник (+2…+12 оС). Применяют также хранение по методу DiLauro et al. в пластиковых пакетах или контейнерах, заполненных кислородом или воздухом [1]. F. Conte et al. предлагают хранить сперму при температуре +4 оС в пластиковых шприцах емкостью 10-60 мл, частично заполненных чистым кислородом, который следует заменять каждые 12 часов [2]. В то же время использование изотонических сред на основе сахаридов с пониженным содержанием катионов - так называемых безэлекторолитных сред - оказалось наиболее эффективным для гипотермического хранения спермы человека и лабораторной мыши [3, 4], что позволило с успехом применить данный подход в репродуктивной медицине [5, 6]. Результаты применения безэлектролитных сред на основе сахаров для хранения спермы осетровых рыб [7-9] дают основание предполагать универсальность подобного подхода и говорить о возможности в перспективе использовать его при исследованиях других видов рыб. Важнейшими прямыми показателями эффективности хранения спермы являются ее оплодотворяющая способность и генетическая безопасность метода, т. е. нормальная выживаемость и отсутствие генетических дефектов у потомства. Ряд косвенных показателей, таких как восстановление подвижности после хранения, содержание АТФ, свободнорадикальное окисление, целостность мембран и фрагментация ДНК, позволяют оценить эффективность метода без оплодотворения и получения потомства. Это особенно важно в рыбоводстве, т. к. дает возможность проводить экспериментальные работы не только во время нерестовых кампаний. Одним из наиболее значимых косвенных показателей эффективности хранения спермы является фрагментация ДНК. Так, исследователи Университета Южной Богемии (Чехия), изучая фрагментацию ДНК при гипотермическом хранении спермы русского и сибирского осетров, выявили зависимость между общими физиологическими показателями спермы и разрушением генетического аппарата [10]. Особенностью стерляди (Acipenser ruthenus) является чрезвычайно низкая даже для осетровых рыб осмоляльность семенной плазмы, которая, по данным разных авторов, составляет ~50-70 мосмоль/кг [11, 12]. При такой низкой осмоляльности сперматозоиды стерляди пребывают в неактивном состоянии, при этом в условиях фактической гипотонии поддержание их жизнеспособности требует активной осморегуляции, механизмы которой в настоящее время не изучены. При гипотермическом хранении, на фоне общего снижения уровня метаболизма, осморегуляция также может быть нарушена, что приведёт к гибели сперматозоидов. В этом исследовании мы предприняли попытку гипотермического хранения спермы стерляди в безэлектролитном растворе глюкозы, трегалозы и альбумина, изотоничном семенной плазме, с целью изучения фрагментации ДНК, сохранности мембран и способности спермы к активации как наиболее значимых косвенных показателей фертильности спермы. Материалы и методы исследований Образцы спермы стерляди от 6 самцов-производителей были получены в рыбоводных целях во время проведения нерестовой кампании на Можайском производственно-экспериментальном рыбоводном заводе (МПЭРЗ) в сентябре 2015 г. Непосредственно после получения для всех образцов была проведена оценка качества спермы по пятибалльной шкале Персова. Концентрацию сперматозоидов определяли в камере Горяева. Для оценки подвижности сперму активировали, разбавляя водой в 50 раз; в течение первых 10-15 секунд оценивали относительное количество подвижных сперматозоидов, затем отмечали время, в течение которого половина подвижных сперматозоидов переходит от поступательных движений к колебательным, и время полной потери подвижности. Сперматокрит определяли центрифугированием образцов в стеклянных гематокритных капиллярах емкостью 75 мм в течение 10 минут при 1000 g. Водородный показатель семенной плазмы определяли при помощи портативного рН-метра «Piccolo» («Hanna Instruments», Германия), осмоляльность - на осмометре-криоскопе «ОСКР-1» («КИВИ осмометрия», Россия). Для гипотермического хранения спермы нами был разработан и использован экспериментальный бессолевой консервант ISGT-80, представляющий собой водный раствор 0,05 М глюкозы, 0,03 М трегалозы и 1 % бычьего сывороточного альбумина (БСА). Нативную сперму разводили консервантом в 4 раза и хранили в криовиалах объемом 2 мл при температуре +4 оС в течение 24 суток. Оценку подвижности спермы проводили каждые 6 суток для всех образцов в течение всего срока гипотермического хранения. Сохранность мембран сперматозоидов оценивали при помощи суправитального теста с эозином по окончании хранения. Фрагментацию ДНК определяли методом SCD-test [13] в свежих образцах и по окончании хранения, сперматозоиды с фрагментированной ДНК определяли по отсутствию окрашенного гало. Данные представлены как M ± SE, где M - среднее, SE - стандартная ошибка среднего. Для выявления связи между показателями применяли непараметрический корреляционный анализ Спирмена. Расчеты и подготовку иллюстративного материала выполняли с использованием пакета программ Statistica 5.0 (StatSoft, Inc.). Результаты исследований и их обсуждение Характеристика образцов. Образцы спермы, которые использовались в ходе исследования, были оценены от 2 до 4 баллов по шкале Персова. Дополнительные характеристики образцов приведены в таблице. Характеристики образцов спермы стерляди № образца Концентрация, млн/мл Сперматокрит, % pH Осмоляльность, мосмоль/кг Подвижность, % 1 330 2,5 7,5 64 85 2 1 050 3,6 6,8 70 98 3 580 0,8 7,0 53 96 4 505 2,9 7,2 54 100 5 300 1,9 7,2 58 86 6 395 1,2 7,4 56 92 n = 6 527 ± 113 2,2 ± 0,4 7,2 ± 0,1 59,2 ± 2,7 92,8 ± 2,6 Корреляций между указанными характеристиками спермы не выявлено. Высокая фертильность спермы (не ниже 75 %) подтверждена в ходе ее использования в производстве. Данные по осмоляльности семенной плазмы, полученные в этом исследовании, сходны с данными, полученными ранее нами (51,3 ± 5,8 мосмоль/кг (n = 7; 2013 г., МПЭРЗ)) [9], а также другими авторами [11, 12]. Подвижность спермы. Зрелые сперматозоиды рыб в семенной плазме пребывают в неподвижном состоянии. После контакта с водой происходит их активация, и сперматозоиды обретают подвижность на короткое время, необходимое для оплодотворения. Относительное количество подвижных сперматозоидов и время сохранения подвижности являются, таким образом, важнейшими характеристиками и необходимыми условиями фертильности спермы. В ходе гипотермического хранения способность спермы осетровых рыб к активации быстро и необратимо снижается, что обусловлено рядом причин: распадом (в том числе, возможно, катаболическим) макроэргических соединений, повреждениями мембран в результате слёживания или осмотических перепадов, преждевременной активацией и пр. В нашем исследовании способность спермы к активации почти полностью утрачивалась во всех образцах на 24 сутки хранения (рис. 1). Рис. 1. Снижение способности спермы стерляди к активации при гипотермическом хранении в течение 24 суток в растворе ISGT-80: < ± среднее; c ± стандартная ошибка среднего; ± стандартное отклонение Корреляции между большинством исходных характеристик спермы (табл.) и способностью к активации в ходе хранения не выявлено. Примечательно, что обнаружена сильная отрицательная корреляция между концентрацией спермы и способностью к активации после 18 суток хранения (Спирмена R = -0,9, p = 0,01). В свежих образцах сперматозоиды сохраняли подвижность после активации в течение 285 ± 63 секунды, время перехода половины сперматозоидов к колебательным движениям - 71 ± 14 секунд. Спустя 6 суток гипотермического хранения время сохранения подвижности увеличивалось, а затем уменьшалось по мере увеличения длительности хранения (рис. 2). Рис. 2. Время сохранения сперматозоидами подвижности после активации в зависимости от длительности гипотермического хранения: p - время, в течение которого более половины сперматозоидов переходит от поступательного движения к колебательному;