Введение Рыбы - пойкилотермные животные, температура их тела зависит от температуры окружающей среды. Известно, что температура влияет на скорость всех биологических процессов (рост, питание, обмен веществ) у рыб, их распределение и поведение. Значительные отклонения температуры за пределы оптимальных величин являются стресс-факторами, снижающими активность рыб и адаптационные способности организма. Кроме того, высокие значения температуры среды негативно влияют на гидрохимический режим в водоеме, способствуя снижению в воде уровня кислорода, а также провоцируя развитие сапрофитной микрофлоры и возбудителей различных болезней [1, 2]. У питающихся рыб адаптация к весеннему потеплению идет по пути снижения концентрации гемоглобина, увеличения скорости оседания эритроцитов, изменения соотношения эритроцитов и лейкоцитов, активизации эритро- и гранулопоэза [3]. Температура влияет на скорость и интенсивность фагоцитоза лейкоцитами периферической крови: низкая температура угнетает способность клеток к поглощению бактерий и снижает скорость выведения продуктов распада антигена из организма рыб [4, 5]. При понижении температуры снижается интенсивность антителогенеза, а также уменьшается эффект проявления иммунологической памяти [5]. Следует отметить, что значения оптимальной температуры максимального антителогенеза отличаются у холодо- и теплолюбивых рыб. У налима и форели (холодолюбивые рыбы) оптимальный антителогенез происходит при температуре 6-9 °С, тогда как у карпа, карася и угря (теплолюбивые виды) при данной температуре антителогенез практически не выражен [4]. Известно, что при термоадаптации гималайского барбуса (золотого махсира) Tor putitora до верхних критических температур у рыб происходит достоверное снижение концентрации и активности каталитических ферментов, кроме того, уменьшается содержание общего белка крови [6]. В то же время уровень глюкозы крови и гемоглобина линейно возрастает. Содержание белых клеток крови повышается до термического оптимума, а затем резко снижается [6]. Данные об изменении соотношения зрелых и незрелых клеток красной крови, наличия/отсутствия патологических изменений, соотношения различных типов лейкоцитов в периферической крови различных видов рыб часто отрывочны и не дают полного представления об изменениях показателей крови при изменениях температуры среды. Особый интерес у исследователей вызывают сведения о верхних летальных температурах (ВЛТ) у различных тепло- и холодолюбивых видов рыб в диапазоне от 27 до 43 °С [7-11]. Несмотря на большой объем полевых и экспериментальных данных по ВЛТ, реакция гематологических показателей рыб на экстремальные температурные условия, нагрев воды при различных значениях скорости, на возможность выживания при сублетальных значениях температуры, а также на сброс подогретых вод тепловых и атомных электростанций изучена недостаточно [12]. Цель работы - определить верхнюю температурную границу жизнедеятельности у серебряного карася Carassius auratus L. и головешки-ротана Perccottus glenii Dybowski, 1877, а также определить направление изменения показателей красной и белой крови у данных видов рыб при различных значениях скорости нагрева воды. Материалы и методики Для опытов была использованы трехлетки серебряного карася и двухлетки головешки-ротана, отловленные в прудах вблизи пос. Борок Ярославской области и в прибрежье Рыбинского водохранилища. Особей акклимировали в течение 10 суток в аквариумах с постоянной аэрацией воды при температуре ~20 °С. Рыб кормили один раз в сутки комбикормом и рыбным фаршем в количестве 5 % от массы тела рыб. После 7-дневного периода акклимации рыб с нормальной двигательной активностью («реакция избегания сачка») отбирали для экспериментов по определению критического термического максимума (КТМ). Группы рыб (по 6 особей в каждой) помещали в экспериментальный аквариум (объемом 60 л) с аэрацией и повышали температуру воды с определенной постоянной скоростью - 4,0; 8,0; 14,0; 25,0 и 40,0 °С/ч. При нагреве со скоростью 4,0; 8,0 и 14,0 °С/ч использовались кипятильники мощностью 0,3; 0,63 и 1,2 кВт соответственно. Более высокую скорость нагрева обеспечивали нагревательными элементами мощностью 2,4 и 3,6 кВт. Скорость нагрева рассчитывалась после завершения опыта по формуле Vн = t2 - t1/T, где Vн - скорость нагрева, °С/ч; t1 - температура воды в начале опыта, °С; t2 - температура воды в конце опыта, °С; T - длительность опыта, ч. Для определения значений ВЛТ использовали стандартный метод КТМ. Температуру, при которой происходил переворот тела рыбы на бок или кверху брюшком, принимали за значение КТМ [8-11]. При дальнейшем нагреве рыбы обычно вскоре погибают. Если же сразу после переворота тела снижать температуру, рыбы, как правило, выживают. Всего в общей сложности исследовали 30 особей серебряного карася (средняя длина тела 6,5 см, средняя масса 6,3 г) и 30 особей головешки-ротана (средняя длина тела 6,6 см, средняя масса 7,3 г). Мазки крови готовили из венозной крови путем каудэктомии после оглушения рыб. Высушенный на воздухе мазок фиксировали в 96-градусном спирте и окрашивали по Романовскому - Гимзе по стандартной методике [13] при рН 7,0. На мазках оценивали эритро- и лейкопоэз. Помимо этого подсчитывали количество поврежденных клеток (эритроцитов), как показатель устойчивости клеток, а также количество амитозов. При оценке эритропоэза определяли относительное количество эритроцитов разной степени зрелости: эритробластов, незрелых и зрелых эритроцитов. Подсчитывали не менее 500 клеток, результаты выражали в процентах. Одновременно вели учет амитотически делящихся эритроцитов, которые определяли по наличию гантелевидных ядер в клетках, микроцитов, а также безъядерных клеток (как результат завершенного амитоза), результат также выражали в процентах. Долю разрушенных клеток на мазке рассчитывали по отношению к общему количеству клеток красной крови. При идентификации лейкоцитов использовали классификацию Н. Т. Ивановой [14]. Процентное соотношение лейкоцитов, или лейкоцитарную формулу, определяли, подсчитывая на мазках 200 клеток белой крови. Количество тромбоцитов подсчитывали параллельно с подсчетом лейкоцитов и их долю рассчитывали, %, по формуле Трц = Трц / (Лк + Трц) · 100, где Лк - лейкоциты, Трц - тромбоциты. Результаты выражали в виде средних значений и их ошибок, достоверность оценивали по критерию Стьюдента при p ≤ 0,05. Результаты исследования и их обсуждение Экспериментальные данные, полученные при определении КТМ у трехлеток серебряного карася и двухлеток головешки-ротана, приведены в табл. 1. Начальные значения КТМ (переворот первой особи) у серебряного карася наблюдались при температуре от ~35 до 37 °С. Аналогичная реакция у последних особей в каждом опыте наблюдалась в диапазоне значений температуры от 36 до 38 °С. Судя по средним значениям, максимальная термоустойчивость серебряного карася отмечена при минимальной скорости нагрева. При всех остальных значениях скорости нагрева средние значения КТМ колебались незначительно, но всегда были на 2-3 °С ниже. В сравнении с серебряным карасем двухлетки головешки-ротана оказались менее термоустойчивыми. Переворот тела на бок или кверху брюшком у первых особей в каждом опыте отмечен при разных значениях скорости нагрева в диапазоне значений температуры от ~31,5 до 34,5 °С, а у последних в каждой серии - от 34 до 36 °С. Динамика средних значений КТМ несколько отличалась от аналогичной у серебряного карася. Хотя показатель КТМ также был максимальным при самой низкой скорости нагрева воды, в дальнейшем наблюдалось некоторое (на 2,5 °С) понижение термоустойчивости. Как известно, значения КТМ отражают сублетальные уровни ВЛТ у рыб [8, 9]. Так, например, известно, что в диапазоне значений температуры от 34 до 38 °С возможный тепловой шок является для рыб «генотоксичным», поскольку вызывает увеличение частоты аберраций хромосом в метафазе, а также приводит к одноцепочечным повреждениям ДНК [15]. В зоне высокой температуры (от 30-32 до 34-35 °С и выше) питание и рост рыб явно угнетены, а возможность повреждающих и летальных последствий весьма велика [15]. Результаты по значениям КТМ при скорости нагрева 4 °С/ч у обоих видов почти совпадают с данными, приведенными в [8], что говорит о возможности устойчивого получения экспериментальных данных по ВЛТ рыб и их использования для экспертной оценки тепловой нагрузки на пресноводные водоемы. Таблица 1 Критический термический максимум у трехлеток серебряного карася и двухлеток головешки-ротана при различных значениях скорости нагрева Скорость нагрева, °С/ч У индивидуальных особей Средняя ± ошибка Серебряный карась 4 36,8 37,0 37,8 37,9 38,1 38,2 37,6 ± 0,2a 8 34,9 36,1 36,1 36,2 36,9 36,9 36,2 ± 0,3б 14 35,8 35,9 36,1 36,9 36,9 37,1 36,5 ± 0,2 б 25 34,9 35,9 35,9 36,1 36 35,9 35,8 ± 0,2б 40 36,0 36,0 36,7 36,7 36,9 36,9 36,5 ± 0,2б Головешка-ротан 4 34,7 34,9 35,8 35,9 36,1 36,1 35,6 ± 0,3а 8 32,9 34,1 33,9 34,1 34,9 34,8 34,1 ± 0,3б 14 31,9 32,8 32,8 32,8 32,9 34,1 32,9 ± 0,3в 25 31,7 33,1 32,9 34,2 34,1 34,1 33,4 ± 0,4в 40 32,1 32,1 33,0 33,0 34 34,1 33,1 ± 0,4в Примечание: Значения показателей с разными индексами в столбце достоверно различаются, p < 0,05. Результаты, полученные при исследовании клеток белой и красной крови двух видов, приведены в табл. 2 и 3. Достоверные изменения показателей крови отмечены у серебряного карася по лейкоцитам - при скорости нагрева более 8,0 °C/ч, по эритроцитам - при скорости более 4,5 °C/ч, у головешки-ротана - 14,0 и 4,5 °C/ч соответственно. Обнаружены достоверно отличающиеся от контроля лимфопения (уменьшение относительного количества лимфоцитов) и нейтрофилия (увеличение долей незрелых нейтрофилов - миелоцитов и метамиелоцитов, тогда как изменений зрелых форм нейтрофилов - палочко- и сегментоядерных нейтрофилов не наблюдали). Выявленные изменения свидетельствуют о том, что клетки белой крови реагируют на резкое повышение температуры реакцией неспецифического стресса, как на действие любых неблагоприятных абиотических и биотических, в том числе антропогенных, факторов [16]. Следует отметить, что доли бластных форм клеток при наименьшей скорости нагрева незначительно повышаются относительно контроля, а потом резко уменьшаются. Это может быть связано с дозреванием клеток и их выбросом в кровяное русло при повышении температуры воды. Среди показателей красной крови следует отметить исчезновение из периферического русла незрелых форм клеток. Данное явление также может быть связано с дозреванием эритроцитов или ускоренным выбросом зрелых клеток из «депо» в селезенке. Достоверное увеличение количества амитозов среди эритроцитов можно считать компенсаторной реакцией красной крови на дефицит кислорода при увеличении температуры воды. Подобное явление описано у карасей, обитающих в дефицитных по содержанию кислорода водоемах [14]. Амитоз, как тип деления, не связанный со сложной перестройкой хроматинового аппарата - это быстрый способ увеличения количества переносчиков кислорода. До сих пор продолжается дискуссия о том, является ли амитоз компенсаторной реакцией на дефицит кислорода, или это признак патологического состояния эритроцитов, т. к. при этом повреждается генетический аппарат клетки, и она становится неспособной к дальнейшему делению [13]. Увеличение количества поврежденных клеток на мазках крови указывает на уменьшение резистентности мембран клеток при резком повышении температуры. Отличия в развитии реакции у серебряного карася и головешки-ротана при разных значениях температуры нагрева может быть связано с их различной чувствительностью к гипоксии при повышении температуры воды. Таблица 2 Соотношение клеток красной и белой крови в периферической крови у трехлеток серебряного карася при различных значениях скорости нагрева воды, %* Показатель Скорость нагрева воды, °С/ч 0 (контроль) 4,5 8,0 14,0 25,0 40,0 Лейкоциты Лимфоциты 73,7 ± 12,2 73,7 ± 6,1 48,6 ± 4,4* 43,8 ± 4,6* 44,0 ± 4,7* 42,7 ± 4,5* Моноциты 1,7 ± 1,1 2,1 ± 1,8 2,1 ± 1,1 2,1 ± 1,0 2,0 ± 0,7 1,9 ± 0,6 Бластные клетки 4,3 ± 1,6 6,4 ±3,8 5,7 ± 2,5 2,5 ± 1,2 2,3 ± 0,9 2,0 ± 0,6 Миелоциты 10,3 ± 5,1 14,6 ±2,2 27,3 ± 5,8* 28,3 ± 4,6* 27,1 ± 3,3* 26,6 ± 1,6* Метамиелоциты 8,1 ± 5,7 5,0 ± 3,1 14,1 ± 0,5 17,3 ± 0,8* 21,0 ± 2,8* 21,5 ± 4,0* Нейтрофилы: палочкоядерные 2,3 ± 3,3 1,2 ± 2,0 2,1 ± 1,5 2,3 ± 1,1 4,1 ± 1,3 4,6 ± 1,8 сегментоядерные 2,4 ± 3,6 3,4 ± 4,4 3,2 ± 0,5 5,1 ± 2,9 2,6 ± 0,8 3,2 ± 0,5 Эритроциты Эритробласты 0,6 ± 0,6 0,1 ± 0,3 0,2 ± 0,4 0,9 ± 1,2 0,2 ± 0,5 0,1 ± 0,3 Эритроциты: незрелые 1,8 ± 1,7 0,4 ± 0,7 2,7 ± 3,6 2,4 ± 4,4 0,7 ± 1,1 0,3 ± 0,7 зрелые 97,6 ± 1,5 99,5 ± 0,7 97,0 ± 3,8 96,7 ± 4,6 99,1 ± 1,5 99,6 ± 0,7 Амитозы 2,6 ± 2,3 8,2 ± 3,4 6,1 ± 7,2 14,9 ± 0,8* 12,7 ± 1,8* 12,5 ± 0,4* Микроциты 1,2 ± 1,5 15,7 ± 6,6* 7,5 ± 5,9 14,4 ± 5,8* 12,6 ± 2,7* 12,7 ± 3,6* Поврежденные клетки 0 2,7 ± 3,8 21,4 ± 7,9* 27,8 ± 5,0* 28,0 ± 4,8 33,6 ± 7,8* * Показатели статистически достоверно отличаются от контроля, p < 0,05. Таблица 3 Соотношение клеток красной и белой крови в периферической крови у двухлеток головешки-ротана при различных значениях скорости нагрева воды, %* Показатель Скорость нагрева воды, °С/ч 0 (контроль) 4,5 8,0 14,0 25,0 40,0 Лейкоциты Лимфоциты 46,6 ± 7,0 42,0 ± 2,1 45,6 ± 5,3 26,3 ± 4,7* 25,3 ± 7,2* 22,4 ± 3,5* Моноциты 0,5 ± 0,7 0,6 ± 0,6 3,3 ± 1,6 1,9 ± 1,7 2,3 ± 0,9 1,7 ± 1,4 Бласты 0,1 ± 0,2 0,3 ± 0,3 1,0 ± 1,0 0,6 ± 0,6 0,8 ± 0,7 1,3 ± 1,1 Промиелоциты 37,7 ± 5,8 43,8 ± 6,5 33,3 ± 2,0 43,7 ± 3,6 46,2 ± 5,0 45,9 ± 3,2 Миелоциты 14,3 ± 2,2 11,6 ± 5,6 13,5 ± 4,7 20,6 ± 4,5 17,9 ± 4,5 19,6 ± 1,9 Нейтрофилы: палочкоядерные 0,4 ± 0,6 0,8 ± 0,8 2,0 ± 1,5 2,3 ± 0,9 2,3 ± 2,4 0,4 ± 0,6 сегментоядерные 0,4 ± 0,5 0,9 ± 0,7 1,3 ± 0,6 2,1 ± 1,3 1,6 ± 1,4 2,7 ± 2,0 Эритроциты Эритробласты 0 0 0,1 ± 0,2 0,3 ± 0,1 0,1 ± 0,1 0 Эритроциты: незрелые 0,1 ± 0,1 0 0,2 ± 0,3 0,4 ± 0,4 0 0,3 ± 0,5 зрелые 99,4 ± 0,9 88,9 ± 4,7 90,9 ± 2,8 86,2 ± 3,6 82,5 ± 13,6 84,7 ± 1,4 Амитозы 0,1 ± 0,2 0 1,0 ± 0,4 2,6 ± 1,6* 1,6 ± 0,7* 0,3 ± 0,5 Микроциты 0,4 ± 0,6 0 0,7 ± 0,4 1,4 ± 0,9 0,7 ± 0,5 0 Поврежденные клетки 0 11,1 ± 4,7* 7,2 ± 3,0* 9,3 ± 3,3* 15,1 ± 1,7* 14,7 ± 1,6* * Показатели статистически достоверно отличаются от контроля, p < 0,05. Таким образом, впервые на примере двух видов рыб - серебряного карася и головешки-ротана - исследованы гематологические показатели (белая и красная кровь) рыб при нагреве воды с разной скоростью. Первые полученные данные свидетельствуют о том, что некоторые гематологические показатели могут служить своеобразными маркерами температурного воздействия на рыб в зоне высоких значений температуры среды. С учетом возможного потепления климата, возникновения аномальных температурных ситуаций в водоемах и увеличения сбросов теплых вод ГРЭС и АЭС, полученные данные возможно использовать для разработки уровней допустимой тепловой нагрузки на естественные водоемы. Выводы 1. Определены значения КТМ у трехлеток серебряного карася и двухлеток головешки-ротана в летний сезон года в при скорости нагрева воды от 4 до 40 °С/ч. Максимальные значения КТМ отмечены при самой низкой скорости нагрева. При остальных значениях скорости нагрева отмечена или их относительная стабильность (серебряный карась) или понижение термоустойчивости (головешка-ротан). Трехлетки серебряного карася более термоустойчивы в сравнении с двухлетками головешки-ротана. 2. Обнаружено, что к нагреву наиболее чувствительны показатели белой крови (соотношение лимфоцитов и незрелых форм гранулоцитов) и красной крови (незрелые формы эритроцитов, амитозы, разрушенные клетки). 3. Установлено сходство реакций на температурное воздействие у серебряного карася и головешки-ротана. Показано, что изменения в белой крови соответствуют неспецифической реакции на стрессовое воздействие, а изменения в красной крови являются компенсаторными реакциями на возникшую гипоксию. 4. В красной крови после воздействия температуры более 10 °С/ч увеличивается количество амитозов (в 3-5 раз) и количество повреждённых эритроцитов (в 1,5-2 раза). В белой крови снижается количество лимфоцитов (в 1,5-2 раза) и увеличивается количество миелоцитов (на 30-45 %).