Введение В настоящее время искусственное воспроизводство осетровых рыб в индустриальных условиях для пополнения природных популяций все больше замещает их естественное воспроизводство. На этом фоне актуализируется предложение о переходе на выращивание крупной молоди в установках замкнутого водоснабжения (УЗВ) [1-3]. К заводским условиям, существенно отличающимся от природных, адаптирован весь цикл воспроизводства - от получения икры до выращивания производителей. Научные и технологические разработки все интенсивнее продвигаются в направлении механизации и унификации процесса воспроизводства осетровых, в то время как изменчивая природная среда предопределяет адаптивное разнообразие половозрелых рыб и их потомства. Объективные данные о негативном влиянии заводского воспроизводства на популяции рыб накапливаются с начала 1980 гг. На примере лососевых и осетровых рыб было показано, что на фоне измельчания и снижения плодовитости искусственно полученной генерации половозрелых рыб происходит устойчивое повышение гетерозиготности производителей и их потомства по генам лактатдегидрогеназы и фосфоглюкомутазы [4-8]. Выявлено также влияние высоких и стандартных плотностей посадки в прудах осетровых рыбоводных заводов (ОРЗ) в Астраханской области на морфогенетические характеристики потомства белуги и севрюги, выражающееся в повышенной гетерозиготности по этим ферментам [9-11]. К настоящему времени вполне определенно установлено негативное влияние заводского воспроизводства на генофонд и рыбоводные характеристики искусственно полученных генераций. Целью нашего исследования было выявление особенностей естественного отбора при выращивании севрюги в условиях полноцикличного культивирования за пределами естественного ареала для оценки целесообразности использования репродуктивных стад, сформированных в искусственных условиях, для пополнения природных популяций и реинтродукции. Материал и методы исследований Исследования проводили на Можайском производственно-экспериментальном рыбоводном заводе (МПЭРЗ) в 2009-2012 гг. Материалом для исследования послужили 753 экз. волжской севрюги, выращенной из икры, привезенной в 2009 г. из Научно-производственного центра по осетроводству «БИОС» (НПЦ «БИОС»). Выращивание проводили в УЗВ со средней температурой воды 20,1 °С, при содержании кислорода от 8 до 3,0 мг/л, водообмене 3-4 раза в час в лотках и бассейнах, кормлении полнорационным комбикормом различных фирм-производителей. Переход на активное питание осуществляли с использованием рачка artemiа salina [12]. Генетико-биохимические исследования проводили методом электрофореза в полиакриламидном геле в лаборатории Всероссийского научно-исследовательского института ирригационного рыбоводства [13]. В качестве генетических маркеров использовали эстеразу (локус Est-2) и лактатдегидрогеназу (локус LDH-3) [14]. Генетическую гетерогенность выборок оценивали по следующим параметрам: частота встречаемости аллелей и генотипов; уровень гетерозиготности наблюдаемой (Ноb) и ожидаемой (Не); отклонение гетерозиготности от ожидаемой (D). Соответствие между наблюдаемыми и теоретически ожидаемыми частотами оценивалось по закону Харди - Вайнберга (критерий χ2) [15]. Данные по частотам генов были проанализированы с помощью теста χ2 на гетерогенность Д. В. Ниля и У. Д. Шелла [16]. Сбор проб, из-за высокой ценности материала, проводили в виде свежего отхода, после перехода личинок на активное питание и достижения размера 30 мм, последовательно на всех этапах выращивания (табл. 1). Самый мелкий и многочисленный отход в виде предличинок и личинок не удалось проанализировать в связи с преобладанием материнского (икорного) генотипа. После перехода личинок на активное питание, в связи с их небольшими размерами, происходила быстрая деструкция организмов в водной среде, и результат исследования зависел не от качества генотипа, а от сохранности белка. В частности, у личинок, собранных после двухчасового пребывания в воде, читаемый фенотип проявлялся только у 10-15 % проб. Погибшие рыбы были объединены по возрасту, в котором они погибли, и количеству отхода за данный период в 3 группы: мелкий, средний и крупный отход. Были проанализированы также все живые особи четырехлетнего возраста (табл. 1). Таблица 1 Характеристика исследованной совокупности севрюги* Год Группа рыб Возраст рыб Количество рыб в стаде, шт. Выход, % Средний вес, г Количество рыб в выборке, шт. 2009 Не исследовали Свободные эмбрионы 3950 80,0 0,028 - Мелкий отход Молодь: начало выращивания конец выращивания 2360 1560 59,0 3,0 224 Средний отход Сеголетки-годовики 987 63,0 33,52 202 2010 Средний отход Годовики и двухлетки 853 86,0 243,98 2011 Крупный отход Двухгодовики и трехлетки 758 89,0 812,23 103 2012 Крупный отход Живые четырехлетки Трехгодовики Четырехлетки 610 305 92,0 1436,1 245 * В процессе выращивания осуществлялась передача севрюги в другие хозяйства, поэтому доля отхода не соответствует количеству оставшихся рыб. Для сравнения и оценки направления отбора использовали собственные данные по молоди и производителям севрюги с ОРЗ в Астраханской области и НПЦ «БИОС» в 2009 г., когда было начато выращивание ремонтно-маточного стада на МПЭРЗ, а также литературные данные по нерестовым мигрантам севрюги в р. Волгу в 1985 г. [14]. Результаты исследований Анализ генетической изменчивости аквакультурной севрюги по локусу ldh-3 показал, что на первых этапах выращивания наблюдается отбор (χ2 = 72,12), направленный против гомозигот. Наблюдаемая гетерозиготность выборок мелкого (0,183) и среднего отхода (0,141) почти в 2 раза ниже ожидаемой гетерозиготности (соответственно 0,339 и 0,358), и основная часть погибшей молоди, сеголеток и годовиков представлена гомозиготами (табл. 2, рис. 1). К двухлетнему возрасту количество погибших рыб уменьшилось до 11 %, гибель рыб происходила в основном за счет травматизации и разрыва желчного пузыря. С этого возраста в группе крупного отхода, который собирали в течение 3-х лет, наблюдается повышение гетерозиготности до 0,383, что почти в 2 раза выше, чем у группы среднего отхода. Гетерозиготность оставшихся живых пятилеток практически не отличается от гетерозиготности группы рыб крупного отхода, что свидетельствует о прекращении средового отбора у рыб после первых двух лет жизни (рис. 1, а). Это означает, что к моменту полового созревания выжили гетерозиготные генотипы, наиболее приспособленные к условиям УЗВ. а б Рис. 1. Распределение в выборках севрюги из индустриальной, прудовой и природной среды по локусу ldh-3: а - гетерозиготности; б - генотипов Для оценки направления отбора в онтогенезе в УЗВ провели сравнение с процессами, которые происходят в природной среде и прудовых условиях ОРЗ в Астраханской области. Из табл. 1 следует, что гетерозиготность молоди, выращенной на ОРЗ, фактически соответствует таковой у выборки погибшей молоди на МПЭРЗ. Генетические показатели выборки живых четырехлеток МПЭРЗ находятся на уровне выборок диких производителей волжской севрюги в 1985 и 2009 гг. Однако, в отличие от них, она неравновесна по критерию χ2 , и в ней отмечен дефицит гетерозигот. В целом наблюдается тенденция к повышению гетерозиготности и у диких производителей севрюги. Анализ распределения генотипов ldh-3 показал дефицит гомозигот обычного аллеля 100/100 и избыток гетерозигот 70/100 у рыб с возраста от двух до четырех лет, выращенных в условиях аквакультуры, по сравнению с совокупностями рыб из природной и прудовой среды (рис. 1, б). На рис. 1 видно, что на первых этапах выращивания генетическая структура отхода наиболее соответствовала соотношению генотипов у выборок рыб из прудовой и природной среды, но большая часть рыб, именно с этими генотипами, оказалась наименее приспособленной к индустриальным условиям выращивания и погибла. Таким образом, полученные нами материалы показывают, что в условиях аквакультуры погибают прежде всего гомозиготные по локусу ldh-3 рыбы групп мелкого и среднего отхода, генетические характеристики которых наиболее соответствуют природным и прудовым популяциям. Таблица 2 Генетические показатели по локусу ldh-3 у севрюги из индустриальной, прудовой и природной среды* Группа рыб Количество, шт. Частота встречаемости аллелей Гетерозиготность D χ2 p 70 ± m 100 ± m 112 ± m Но ± m Не ± m мелкий отход 224 0,216 ± 0,02 0,784 ± 0,02 0 0,183 ± 0,025 0,339 ± 0,022 -0,46 47,5 < 0,001 средний отход 198 0,232 ± 0,03 0,768 ± 0,03 0 0,141 ± 0,035 0,358 ± 0,032 -0,604 72,12 < 0,001 крупный отход 107 0,453 ± 0,034 0,548 ± 0,034 0 0,383 ± 0,047 0,496 ± 0,007 -0,227 5,508 < 0,05 живые четырехлетки, МПЭРЗ 217 0,436 ± 0,025 0,564 ± 0,025 0 0,359 ± 0,034 0,492 ± 0,007 -0,27 14,221 < 0,001 молодь, НПЦ «БИОС», 2009 г. 195 0,082 ± 0,014 0,918 ± 0,014 0 0,113 ± 0,023 0,151 ± 0,023 -0,251 12,29 < 0,001 молодь всех ОРЗ, 2009 г. 714 0,078 ± 0,007 0,882 ± 0,009 0,04 ± 0,005 0,212 ± 0,015 0,215 ± 0,014 -0,016 11,558 < 0,05 Производители, 2009 г. 99 0,813 ± 0,028 0,106 ± 0,022 0,081 ± 0,019 0,313 ± 0,047 0,321 ± 0,040 -0,025 3,868 > 0,05 Производители, 1985 г. 485 0,852 ± 0,015 0,134 ± 0,015 0,041 ± 0,005 0,309 ± 0,021 0,303 ± 0,017 0,026 9,220 >0,05 * Выделены частоты аллелей, по которым обнаружены достоверные различия между группами рыб. Таблица 3 Генетические показатели по локусу Est-2 у севрюги из индустриальной, прудовой и природной среды* Группа рыб Количество, шт. Частота встречаемости аллелей Гетерозиготность D χ2 p a ± m c ± m d ± m e ± m i ± m Но ± m Нe ± m мелкий отход 224 0,025 ± 0,007 0 0,19 ± 0,018 0,786 ± 0,019 0 0,317 ± 0,031 0,346 ± 0,024 -0,08 3,57 01 средний отход 202 0,129 ± 0,024 0,025 ± 0,011 0,045 ± 0,015 0,792 ± 0,029 0,01 ± 0,007 0,208 ± 0,040 0,353 ± 0,040 -0,412 17,69 < 0,001 крупный отход 103 0,019 ± 0,007 0 0,079 ± 0,014 0,902 ± 0,016 0 0,109 ± 0,023 0,184 ± 0,025 -0,39 48,4 < 0,01 живые четырехлетки, МПЭРЗ 245 0,047 ± 0,010 0,002 ± 0,002 0,071 ± 0,012 0,880 ± 0,015 0 0,151 ± 0,023 0,219 ± 0,024 -0,31 60,32 < 0,05 молодь, НПЦ «БИОС», 2009 г. 195 0,027 ± 0,01 0,24 ± 0,009 0,079 ± 0,016 0,866 ± 0,02 0,003 ± 0,003 0,212 ± 0,034 0,242 ± 0,032 -0,12 ± 0,168 107,46 < 0,01 молодь всех ОРЗ, 2009 г. 700 0,324 ± 0,01 0,009 ± 0,009 0,118 ± 0,016 0,832 ± 0,02 0,008 ± 0,003 0,192 ± 0,034 0,219 ± 0,032 -0,34 ± 0,168 758,0 < 0,001 Производители, 2009 г. 99 0,081 ± 0,005 0,071 ± 0,003 0,061 ± 0,009 0,763 ± 0,01 0,025 ± 0,002 0,313 ± 0,016 0,403 ± 0,016 -0,22 42,6 > 0,001 Производители, 1985 г. 430 0,057 ± 0,008 0,062 ± 0,008 0,097 ± 0,01 0,78 ± 0,014 0,005 ± 0,002 0,271 ± 0,21 0,375 ± 0,02 -0,33 234,8 < 0,001 * Выделены частоты аллелей, по которым обнаружены достоверные различия между группами рыб. Исследование генетической изменчивости аквакультурной севрюги по локусу Est-2 показало, что, в отличие от локуса ldh-3, в первые 2 года выращивания происходил отбор рыб с гетерозиготным генотипом, поэтому гетерозиготность была высокой (0,317 и 0,208) по сравнению с гетерозиготностью групп крупного отхода и живых четырехлеток (0,109 и 0,151) (табл. 3, рис. 2, а). Гетерозиготность производителей севрюги в 2009 г. была на уровне гетерозиготности у выборки погибшей молоди МПЭРЗ - 0,317 и 0,313 соответственно. Это свидетельствует о том, что по локусу Est-2 на первых этапах выращивания отбор идет против гетерозигот. Гетерозиготность группы рыб, оставшихся в живых, почти в 2 раза меньше гетерозиготности природных производителей. Анализ динамики в процессе выращивания количества самых распространенных генотипов - гомозиготного ее и гетерозиготного de, позволил выявить, что тенденция динамики генотипа ее зеркально отражает варьирование гетерозиготности у сравниваемых групп рыб (рис. 2). Вследствие этого можно сделать вывод, что в индустриальных условиях отбор по локусу Est-2 идет против гетерозигот всех типов и преимущество получают гомозиготы распространенного аллеля ее. а б Рис. 2. Распределение в выборках севрюги из индустриальной, прудовой и природной среды по локусу Est-2: а - гетерозиготности; б - генотипов Следовательно, по локусу Est-2, аналогично локусу ldh-3, на первых этапах выращивания происходил отбор против генотипов, доминирующих в природной и прудовой среде, только в данном случае отмечена направленность отбора против гетерозигот. Сравнение по тесту на гетерогенность выживших четырехлеток с производителями 2009 г., из совокупности которых происходила аквакультурная севрюга, показало между ними достоверные различия (р > 0,001) по частоте встречаемости в локусе ldh-3 аллелей 70 и 100 (р > 0,001 при χ2 20,8 и 100,58 соответственно) и по частоте встречаемости в локсусе Est-2 распространенного аллеля е (χ2 - 5,354, р > 0,05) и аллеля с (χ2 - 45,89, р > 0,001), при выщеплении редкого аллеля i (табл. 2, 3). Таким образом, создана совокупность рыб, прошедших отбор на приспособленность к индустриальным условиям выращивания, достоверно отличающаяся по генетическим параметрам от природных популяций севрюги. Обсуждение результатов Генетическая структура любой совокупности организмов находится под влиянием условий среды. Адаптивный характер белкового полиморфизма позволяет оценить это влияние, поскольку в трансформированных условиях среды получают преимущество особи с теми или иными генотипами ферментов. Нами исследованы ферменты, включенные в дыхательный и пищеварительный процессы, которые в индустриальных условиях подвергаются наиболее сильному воздействию из-за кормления рыбы искусственными полнорационными кормами; измененного качественного состава воды, характеризующегося высоким содержанием азота и низким кислорода; искаженного светового и температурного режимов, а также других факторов. Связь количества кислорода в воде с выживаемостью молоди севрюги с разными генотипами по локусам ldh была ранее экспериментально выявлена в аквариальных емкостях [17]. Позже было показано устойчивое повышение у молоди севрюги доли гетерозигот по локусам ldh-3 и ldh-4 при прудовом выращивании с высокими значениями плотности посадки и во втором рыбоводном цикле, когда из-за высокой температуры снижается насыщение воды кислородом [8-11, 17]. Аналогичная тенденция к увеличению доли гетерозигот по локусу ldh-3 и гетерозиготности у живых четырехлеток севрюги наблюдается и в нашем опыте на МПЭРЗ, проходившем в производственных условиях при высоких значениях плотности посадки и колебаниях кислорода. Наблюдаемый отбор в пользу гетерозигот можно отнести к одному из проявлений стабилизирующего отбора, когда множественность генных продуктов и их комбинаций позволяет гетерозиготному организму поддерживать постоянство своих функций в широком диапазоне изменений среды [18]. На популяционном уровне это позволяет совокупности рыб восстанавливать свою структуру за счет генетического гомеостаза и не имеет изначально негативного характера [19]. Однако на примере локуса Est-2 отмечено проявление дизруптивного отбора, при котором происходит фиксация одного аллеля с утерей другого (в нашем случае аллеля i и, в перспективе, аллеля с). Рыбы, гетерозиготные по локусу эстеразы, оказались менее приспособленными к условиям УЗВ, чем гомозиготные с генотипом ее. Можно было бы предположить, что это направление отбора связано с качеством искусственного корма, к которому адаптируется рыба, но с увеличением среди волжских производителей севрюги доли рыб искусственного происхождения и у заводской молоди также возрастает количество гомозигот «распространенного» аллеля е и сокращается количество редких аллелей [11, 20, 21]. Таким образом, направления отбора в онтогенезе севрюги в условиях УЗВ по локусам ldh-3 и Est-2 в целом совпадают с таковыми при искусственном воспроизводстве севрюги на ОРЗ в Астраханской области, но имеют более выраженный характер. На лосососевых видах рыб и стерляди показано также, что одомашнивание и искусственное разведение приводят к потере аллельных генов, повышению или снижению наблюдаемой гетерозиготности в зависимости от направления отбора - дизруптивного или стабилизирующего [18, 21-23]. Разнонаправленность отбора по разным локусам связана с тем, что «любая природная популяция эволюционирует одновременно по множеству локусов и соответствующие генотипы могут взаимодействовать самым различным образом» [18, с. 51]. Наблюдаемая трансформация генетической структуры искусственных популяций рыб непосредственно связана с деградацией их рыбоводных и продукционных характеристик [6-9, 11, 18, 20]. Ранее для севрюги нами было показано, что гомозиготы по локусам ldh-3 и ldh-4 по сравнению с гетерозиготами характеризуются более крупными размерами и массой, а гетерозиготы по локусу фосфоглюкомутазы отличаются более ранним созреванием и мелкими размерами [24]. В связи с этим для предотвращения возможных последствий искусственного воспроизводства на ОРЗ, при выращивании крупной молоди осетровых в УЗВ и во всех репродуктивных стадах, необходимо проводить генетический мониторинг и паспортизацию рыб не только по ДНК-маркерам, но и с учетом генетико-биохимического полиморфизма рыб по адаптивным ферментным системам. Эти данные необходимы для разработки мер по поддержанию генетического разнообразия в искусственно созданных репродуктивных стадах, природных популяциях севрюги и для селекции. Репродуктивное стадо севрюги, выращенное в условиях УЗВ, в силу его геноспецифичности, может быть использовано, с одной стороны, как основа для селекционной работы, а с другой, при направленном пополнении генофонда или генетически обоснованном подборе родительских пар, - для реинтродукции в природную среду. Заключение Полученные нами материалы по генетической изменчивости севрюги в онтогенезе позволяют уверенно констатировать, что индустриальные условия воспроизводства и выращивания обусловили достоверные изменения в генетической структуре данного репродуктивного стада. Впервые выявлено, что в индустриальных условиях отбор по локусу Est-2 идет против гетерозигот всех типов и преимущество получают гомозиготы распространенного аллеля ее, а по локусу ldh-3 отбор направлен против гомозигот 70/70 и 100/100. Показано, что в условиях УЗВ происходит трансформация генофонда в направлении, которое отлично от направления трансформации генофонда интактных естественных популяций. В связи с этим выращенное репродуктивное стадо можно использовать для реинтродукции в природную среду только после генетико-биохимической паспортизации и (или) пополнения генофонда выращенного репродуктивного стада.