Введение Механизмы действия различных факторов среды на пищеварительные процессы достаточно подробно изучены у высших позвоночных животных, а также у некоторых видов рыб [1–4]. В то же время работ, посвященных изучению влияния этих факторов на пищеварительные ферменты осетровых видов рыб, немного [4–6]. Следует отметить, что наибольший интерес представляет изучение влияния температуры и рН, относящихся к основным абиотическим факторам среды, которые определяют целый ряд параметров жизнедеятельности рыб (скорость протекания метаболических процессов, интенсивность питания, скорость усвоения пищи), а также влияют на различные характеристики ферментов. В связи с этим целью исследований явилось изучение влияния различных значений температуры и рН инкубации на уровень активности некоторых пищеварительных ферментов слизистой оболочки кишечника у представителя сем. Acipenseridae – русского осетра. Материал и методика исследований Нами были исследованы 44 экз. годовиков русского осетра (Acipenser güldenstädtii B.), выращенных в искусственных условиях. Пойманных рыб в специальных ёмкостях течение 1–2 часов доставляли в лабораторию, где у них на холоде изымали желудочно-кишечный тракт и специальным скребком снимали слизистую оболочку кишечника. Гомогенаты готовили при помощи гомогенизатора (лабораторный гомогенизатор Daihan Scientiic), добавляя охлажденный до температуры 2–4 оС раствор Рингера для холоднокровных животных (109 мМ NaCl, 1,9 мМ KCl, 1,1 мМ CaCl2, 1,2 мМ NaHCO3) в соотношении 1 : 49. При исследовании влияния температуры содержимое пробирок инкубировали при температуре в диапазоне 0–70 ºС для щелочной фосфатазы, мальтазы и казеинлитических протеиназ и в диапазоне 0–60 ºС для α-амилазы (при рН 7,4). Определение влияния рН проводили в диапазоне 3–12 при температуре инкубации 25 ºС. Уровень активности α-амилазы (КФ 3.1.1.1) определяли по убыли крахмала модифицированным методом Смита и Роя, уровень активности мальтазы (КФ 3.2.1.20) – модифицированным глюкозооксидазным методом, щелочной фосфатазы (КФ 3.1.3.1) – по степени гидролиза n-нитро-фенилфосфата Na. Казеинлитическую активность протеиназ (КФ 3.4.21) определяли модифицированным методом Ансона [7]. В качестве субстратов были использованы: для α-амилазы – 0,1 %-й раствор крахмала; для мальтазы – 2 %-й раствор мальтозы; для щелочной фосфатазы – 0,6 мМ раствор n-нитро-фенилфосфата Na, приготовленный на растворе Рингера; для казеинлитических протеиназ – 1 %-й раствор казеина, приготовленный на фосфатном буфере (1/15 M Na2HPO4 · 2H2O и 1/15 M KH2PO4 в соотношении 4 : 1). Активность ферментов выражали в мг или мкмоль продукта гидролиза, образующегося за 1 минуту инкубации в расчёте на 1 г влажной массы слизистой. Статистическую обработку данных проводили по общепринятым методикам [8]. Данные обрабатывали с использованием приложения EXEL программы MS Office для WINDOWS XP. Результаты исследования Результаты влияния температуры инкубации на уровень активности ферментов слизистой оболочки кишечника русского осетра представлены в табл. 1. Таблица 1 Влияние температуры инкубации на уровень активности пищеварительных ферментов слизистой оболочки кишечника русского осетра, мкмоль/(г·мин) Т, ºСα-Амилаза*МальтазаЩелочная фосфатазаКазеинлитические протеиназы 06,26 ± 0,353,93 ± 0,130,30 ± 0,011,28 ± 0,14 106,44 ± 0,185,51 ± 0,250,30 ± 0,011,46 ± 0,20 206,88 ± 0,358,32 ± 0,130,38 ± 0,012,03 ± 0,16 256,88 ± 0,44––– 308,29 ± 0,2712,95 ± 0,400,51 ± 0,013,88 ± 0,21 407,59 ± 0,2717,46 ± 0,150,82 ± 0,017,47 ± 0,33 505,64 ± 0.2118,10 ± 0,061,14 ± 0,0112,82 ± 0,34 55–18,82 ± 0,151,37 ± 0,01– 600,94 ± 0,1119,59 ± 0,131,46 ± 0,029,04 ± 0,48 65––1,47 ± 0,02– 70–7,49 ± 0,251,18 ± 0,031,91 ± 0,17 * Мг/(г·мин). Как видно из табл. 1, температурный оптимум щелочной фосфатазы русского осетра составляет 60–65 ºС, что соответствует полученным ранее данным для представителей других экологических групп. Так, температурный оптимум данного фермента слизистой оболочки кишечника скумбрии, ставриды и сардинеллы соответствует 50–60 ºС [9]. Высокие значения температурного оптимума щелочной фосфатазы отмечены и у представителей Волжского бассейна. Так, например, у судака, окуня, карпа, карася оптимум фермента равен 50 ºС [2]. Было отмечено также, что при температуре 0 ºС активность щелочной фосфатазы составляет 92 % у судака и 88 % у леща от максимальной активности, принятой за 100 % [2], в то время как у русского осетра активность данного фермента при температуре 0 ºС составляет лишь 20 % от максимальной. Аналогичная закономерность была обнаружена ранее для кеты [10] и ленского осетра [11]. Для α-амилазы слизистой оболочки кишечника русского осетра отмечены низкие значения температурного оптимума – 30 ºС. Температурный оптимум данного фермента у рыб, обитающих в Волго-Каспийском бассейне, обнаруживается, как правило, при температуре 40 ºС [12]. Такое же значение температурного оптимума отмечено у других исследованных представителей сем. Acipenseridae, обитающих в северных широтах [11]. Несмотря на низкие значения температурного оптимума, у русского осетра активность ферментов при температуре 0 ºС достаточно высока и составляет 76 % от максимального значения, в то время как у большинства пресноводных костистых рыб – лишь 15 % [2]. Температурный оптимум мальтазы у русского осетра соответствует таковому для рыб Волго-Каспийского бассейна и составляет 60 ºС. Относительная активность мальтазы при температуре инкубации 0 ºС составляет 20 %, что также соотносится с характеристикой рыб Волго-Каспийского бассейна [3] и сем. Acipenseridae [11]. Значения температурного оптимума для казеинлитических протеиназ слизистой оболочки кишечника русского осетра обнаружены при температуре 50 ºС. Относительная активность данного фермента при температуре 0 ºС у русского осетра намного ниже, чем у костистых видов рыб Волжского бассейна и составляет 10 и 35–70 % соответственно от максимума, что является характерным для представителей данного семейства [11]. В табл. 2 представлены данные по влиянию рН инкубационной среды на уровень активности ферментов слизистой оболочки кишечника русского осетра. Таблица 2 Влияние рН инкубации на уровень активности пищеварительных ферментов слизистой оболочки кишечника русского осетра, мкмоль/(г·мин) рНα-Амилаза*МальтазаЩелочная фосфатазаКазеинлитические протеиназы 32,50 ± 0,233,12 ± 0,150,29 ± 0,01– 43,91 ± 0,405,12 ± 0,150,31 ± 0,01– 54,39 ± 0,336.70 ± 0,230,30 ± 0,01– 65,52 ± 0,1210,43 ± 0,230,31 ± 0,014,38 ± 0,04 78,10 ± 0,1112,84 ± 0.190,33 ± 0,017,05 ± 0,09 88,06 ± 0,2212,60 ± 0,230,35 ± 0,018,95 ± 0,02 97,33 ± 0,1710,95 ± 0,230,36 ± 0,019,75 ± 0,07 107,00 ± 0.115,16 ± 0,110,28 ± 0,0110,43 ± 0,09 116,54 ± 0,114,67 ± 0,040,18 ± 0,017,58 ± 0,15 125,25 ± 0,024,52 ± 0,080,15 ± 0,011,41 ± 0,09 * Мг/(г·мин). Из данных табл. 2 видно, что максимальная активность α-амилазы и мальтазы обнаружена при рН 7–8, для щелочной фосфатазы 8–9 и для казеинлитических протеиназ – при рН 10. Данные оптимумы соответствуют таковым для рыб Волжского бассейна [3, 4] и представителей сем. Acipenseridae [11]. Заключение Еще в XIX в. при исследовании некоторых ферментов рыб были получены данные, свидетельствующие об их способности функционировать при значениях температуры близких к 0 ºС, когда ферменты теплокровных животных практически утрачивают активность [2]. Ранее при исследовании температурных адаптаций осетровых видов рыб нами [3] было установлено, что пищеварительные гидролазы белуги, стерляди, севрюги и ленского осетра сохраняют от 13 до 27 % своей активности при температуре 0 ºС. Полученные нами данные свидетельствуют об идентичности ответной реакции ферментов слизистой оболочки кишечника русского осетра на изменение температуры инкубации ответной реакции таковых других представителей сем. Acipenseridae. Таким образом, в ходе исследований подтверждено, что адаптационные перестройки пищеварительной системы пойкилотермных организмов (проведенные на основе анализа уровня активности пищеварительных гидролаз) реализуются главным образом благодаря перестройкам ферментных систем. Можно предположить, что, по-видимому, имеет место эволюционная адаптация гидролитической функции кишечника рыб к условиям среды обитания.